Herramientas Analí.cas Cromatogra>a de Líquidos

Transcripción

1 Herramientas Analí.cas Cromatogra>a de Líquidos

2 Cromatogra>a Historia Mikhail Semenovich TsweH ( ) trabajó en la separación de fragmentos (clorofila y carotenoides) En 1903 publicó On a new category of adsorp.on phenomena and their applica.on to biochemical analysis En 1906 reportó haber separado los cons.tuyentes de las hojas pasándolos por una columna de carbonato de calcio, alumina y sucrosa. Acuño la palabra Cromatography de palabras griegas indicando color y escritura Trabajos olvidados

3 Cromatogra>a Historia For prac.cal purposes, chromatography began with the Bri.sh biochemist, A. J. P. Mar.n, in the early 1940s. Apparently Mar.n had made some notes with a fountain pen on a paper napkin. When some spilled tea wet a corner of the napkin, it spread across the paper, some of the colored dyes in the ink moved with it and Mar.n discovered paper chromatography. He also rediscovered column chromatography (apparently independently). The art is s.ll progressing. hhp://

4 Cromatogra>a Principios La idea es que el analito interaccione con diferentes solventes o matrices y que exista una ahracción o retención diferencial Si el analito interacciona igual, la separación no es posible Analy.cal Chemistry, Gary D. Chris.an, Wiley

5 Cromatogra>a es una técnica de Separación 1. Con.ene 2 solventes inmiscibles, se agrega el analito y se mezclan. En equilibrio el analito se distribuye en la fase donde se disolvió o retuvo mejor. Extracción 2. Por distribución de sus componentes en dos fases, una que se mueve y otra que está estacionaria (.picamente una columna) hhp://zyklon1985.blogspot.com/2007_06_01_archive.html Modern analy.cal chemistry (Harvey D.) (MGH, 2000)

6 Cromatogra>a es una técnica de Separación 1. Con.ene 2 solventes inmiscibles, se agrega el analito y se mezclan. En equilibrio el analito se distribuye en la fase donde se disolvió o retuvo mejor. Extracción hhp://zyklon1985.blogspot.com/2007_06_01_archive.html Modern analy.cal chemistry (Harvey D.) (MGH, 2000)

7 BT2008 Diagnós.co Molecular 1 Cromatogra>a de 2 fases Ejemplo DNA hhp://zyklon1985.blogspot.com/2007_06_01_archive.html

8 2 Fases Mas A, menos puro Modern analy.cal chemistry (Harvey D.)

9 2 Fases Mas Puro, menos A Modern analy.cal chemistry (Harvey D.)

10 Cromatogra>a es una técnica de Separación Por distribución de sus componentes en dos fases, una que se mueve y otra que está estacionaria (.picamente una columna) Analy.cal Chemistry, Gary D. Chris.an, Wiley

11 Cromatogra>a es una técnica de Separación 1. (2) 2. Por distribución de sus componentes en dos fases, una que se mueve y otra que está estacionaria (.picamente una columna) Cromatograma (a) (b) (c) (d) (e) Modern analy.cal chemistry (Harvey D.) (MGH, 2000)

12 Cromatogra>a Tiempo de Retención Tiempo de retención :.empo desde la inyección hasta la elución máxima Tiempo nulo (void.me): Tiempo hasta le primera elución Volumen de retención: volumen de fase móbil necesario para hacer que el analito eluya Ancho base (baseline width) w: rango de.empo en el que se detecta el analito Volumen nulo: Volumen de fase hasta la primera elución Modern analy.cal chemistry (Harvey D.) (MGH, 2000)

13 Cromatogra>a Resolución El obje.vo de cromatogra>a es separar componentes de una muestra. Resolución es una medida cuan.ta.va del grado o calidad de la separación entre 2 picos Modern analy.cal chemistry (Harvey D.) (MGH, 2000)

14 Cromatogra>a Factor de Capacidad M mobile, S Sta.onary Coeficiente de Distribución o Par.ción Capacity Factor Fácilmente Medible Modern analy.cal chemistry (Harvey D.) (MGH, 2000)

15 Cromatogra>a Factor de Selec.vidad Factor de Selec.vidad: Relación de los factores de capacidad de 2 analitos Modern analy.cal chemistry (Harvey D.) (MGH, 2000)

16 Cromatogra>a Eficiencia de la Columna Secciones Cromatográficas Teóricas (Theore.cal Plates) es una medida de la eficiencia de la columna. (aprox) Modern analy.cal chemistry (Harvey D.) (MGH, 2000)

17 Cromatogra>a Resolución Incremento en eficiencia de la columna Modern analy.cal chemistry (Harvey D.) (MGH, 2000) Incremento en Selec.vidad de la columna

18 Cromatogra>a Clasificación de Técnicas Absorción, Par.ción, Intercambio Iónico, Exclusión de Tamaño, Electroforésis Analy.cal Chemistry, Gary D. Chris.an, Wiley Modern analy.cal chemistry (Harvey D.) (MGH, 2000)

19 Cromatogra>a de Absorción El analito/soluto es absorbido en la superficie Separación por diferentes capacidades de absorción hhp:// eng/biotech Environ/CHROMO/be_types.htm

20 Cromatogra>a de Par.ción El analito/soluto es retenido en un soporte sólido superficie de una película delgada hhp:// eng/biotech Environ/CHROMO/be_types.htm

21 BT2008 Diagnós.co Molecular 1 Cromatogra>a Par.ción / Absorción (eje. en papel) hhp://liston.50megs.com/unit3.html hhp://commons.wikimedia.org/wiki/category:chromatography

22 Cromatogra>a de Intercambio Iónico Usa una resina (soporte sólido) con ca.ones o aniones unidos covalentemente Algunos son atrapados por las cargas mientras otros no hhp:// eng/biotech Environ/CHROMO/be_types.htm

23 Cromatogra>a de Exclusión de Tamaños Geles porosos son usados como el soporte sólido Grandes solutos no penetran fácilmente los poros, los pequeños pasan libremente En electroforésis, no hay fase móbil sino que se usa un campo eléctrico para producir el movimiento.

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25 Cromatogra>a de Afinidad Es el mas selec.vo Usa interacción específica entre dos.pos de moléculas El soporte sólido que.ene unidos (covalentemente) las moléculas que atrapan P.Ej. An.cuerpos Una vez atrapados, las moleculas atrapadas se pueden eluir usando una solución especial que cancela la interacción (cambio de ph, iones, etc).

26 (Chem) Handbook of Instrumental Techniques for Analy.cal Chemistry SeHle Pren.ce Hall

27 (Chem) Handbook of Instrumental Techniques for Analy.cal Chemistry SeHle Pren.ce Hall

28 Cromatogra>a de Líquidos HPLC High Performance Liquid Chromatography Cromatogra>a en general es basada en un fenómeno de difusión el cual es muy lento Se usa una bomba para inyectar la fáse móvil Para lograr rapidez: El empacado de la columna debe ser fino y altamene esférico para que sea denso y regular La fase líquida estacionaria debe ser una película delgada uniforme Muchas columnas comerciales cumplen estas carácterís.cas Una de las primeras mas exitosas es Zipax de Du Pont con porosidad controlable