Curso interactivo de cromatografía de líquidos. Módulo 1 parte A. Dr. Juan Carlos Vázquez Lira Abril 2016
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- Mercedes Hidalgo Ramos
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1 Curso interactivo de cromatografía de líquidos Módulo 1 parte A Dr. Juan Carlos Vázquez Lira Abril 2016
2 Bases de la cromatografía
3 CROMATOGRAFÍA Separación Determinación
4 La cromatografía es una técnica físico-química de separación en el que los componentes de la muestra se distribuyen entre dos fases, una de las cuales es fija o estacionaria y la otra móvil. La velocidad de desplazamiento es función del coeficiente de distribución de cada componente entre las dos fases. K D = [A] [A] FE FM FE sólido líquido FM gas líquido gel fluido sc
5 Fundamento del proceso cromatográfico Forma de realizar dicho proceso tipos de cromatografías técnicas cromatográficas la naturaleza de las fases móvil y estacionaria y la clase de equilibrios implicados en la transferencia de los solutos entre las fases, es decir, el mecanismo de interacción dispositivo utilizado para conseguir el contacto entre la fase móvil y la estacionaria
6 Clasificación La naturaleza de la fase estacionaria Sólido (adsorción, reparto, intercambio iónico, afinidad, micelar, interacción hidrofóbica, partición centrifuga, quiral, pares de iones, exclusión molecular) sólido-líquido (LSC) sólido-gas (GSC) Sólido-Fluido supercrítico (SFS) Líquido ( reparto, intercambio iónico, afinidad, micelar, interacción hidrofóbica, partición centrifuga, quiral, pares de iones, exclusión molecular) líquido-líquido (LLC) líquido-gas (GLC) líquido-fluido supercrítico (LFS)
7 Clasificación El dispositivo experimental Plana Columna Aplicación Analítica 1 pg- 1mg Semipreparativa 1mg- 1g Preparativa > 1g
8 Elución de solutos: Cromatografía Gravedad Presión Fuerza centrífuga Potencial eléctrico CROMATOGRAFÍA COLUMNA PLANA CG CII ELC CL ADSORCIÓN CAF CFS CCF Papel CPE CEX CPC FASE ENLAZADA Fase Normal (Fase estacionaria polar fase móvil no plar) Fase reversa (Fase estacionaria no polar fase móvil polar)
9 Se alimenta continuamente a la columna con una solución de la muestra, de esta forma se obtienen datos termodinámicos. Cuando la columna se satura comienzan a eluir los solutos en el efluente.
10 Se introduce la muestra como una solución. En una sola porción pero se hacen que los componentes eluyan por la columna por la adición continua de una solución o soluto que es más afin por la fase estacionaria que cualquier otro de los componentes de la muestra. Es utlizado más a escala preparativa.
11 Proceso por el cual el soluto es transportado por la columna añadiendo más disolvente ( elución) y es la forma más corriente de realizar una separación.
12 CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS Incremento de polaridad Insoluble en agua Soluble en agua No polar Ionico No iónico polar 1.0E+02 Adsorción Fase reversa Reparto Fase normal Intercambio iónico 1.0E+03 Molecular Weight 1.0E+04 Permeación en gel Exclusión Filtración en gel 1.0E E+06
13 Cromatografía líquida clásica - Fase estacionaria ( mm) - Columna vidrio (1 m) - Fuerza impulsora gravedad Inconvenientes -Columnas muy largas en separaciones difíciles -Eficiencia baja -Poca sensibilidad -Tiempo análisis largo -Consumo muy alto disolventes
14 Cromatografía de líquidos Reducción del tamaño de partícula para incrementar la eficiencia HPLC UPLC (reciente) CLAR CLAE CLAP CLUE (reciente) CLUR (reciente)
15 Cromatografía líquida de alta eficiencia (CLAR, HPLC) Fases estacionarias (3-10 mm) Ventajas: -Alta eficiencia -Sensibilidad -Tiempo análisis corto -Consumo disolventes reducido
16 Proceso físico - químico que rige la separación: -Adsorción: Mecanismos de la separación (1) El soluto se adsorbe en la superficie de las partículas sólidas de la fase estacionaria. Es un fenómeno superficial, aumentado con la formación de puentes de hidrógeno.
17 Mecanismos de la separación (2) - Reparto: El soluto se equilibra entre el líquido de la fase estacionaria y la fase móvil, por diferencia de solubilidad. Hasta llegar a un equilibrio
18 Mecanismos de la separación (3) - Intercambio Iónico: Los aniones o cationes se unen covalentemente a la fase estacionaria sólida
19 Mecanismos de la separación (4) - Exclusión Molecular, Filtración o Permeación en Gel: No existen interacciones entre la fase estacionaria y el soluto. Se separa por tamaño de partícula.
20 La interacción de los solutos con la fase estacionaria es debida a interacciones tipo llave-cerradura muy selectivas Mecanismos de la separación (5) - Afinidad
21 Bases de la separación Coeficiente de reparto K de un analito: K = C s /C m C = Concentración del analito s = fase estacionaria m = fase móvil V s = volume de fase estacionaria V m = volume de fase móvil
22 Proceso por el cual la FM atraviesa la columna Eluyente columna eluato Velocidad de flujo (ml/min) (F) volumen de disolvente que atraviesa la columna por minuto V 0 Velocidad lineal (cm/min) (u) longitud de columna atravesada por el disolvente en un minuto Representa físicamente los espacios intersticiales entre las partículas empaquetadas en la columna que son accesibles a la FM, e incluye además los volúmenes internos del sistema hasta su detección
23 Volumen muerto V o, Es el volumen de fase móvil dentro de la columna D 0.65 Volumen muerto = 65% del volumen 0 de la columna vacía 4 V 2 L
24 Determinación del volumen de fase móvil dentro de la columna Vo Métodos directos Uso de compuestos inorgánicos y orgánicos no retenidos Métodos indirectos Marcación isotópica
25 Información analítica relativa a la muestra Representación gráfica de la respuesta del detector en función del tiempo, volumen de eluyente o distancia en el lecho cromatográfico funcionamiento del sistema cromatográfico t 0 intervalo de tiempo que transcurre desde que el trazador es insertado al principio del lecho cromatográfico hasta que sale del mismo t R el tiempo que tarda el máximo de un pico en ser eluido después de la inyección t R t' R = t R - t o diferencia entre el tiempo de retención del analito y el volumen muerto de la columna, es decir, el tiempo que un analito es retenido en la columna comparado con un compuesto no retenido
26 Respuesta CROMATOGRAMA t r2 t r1 t o t r1 Inyección Tiempo ó volumen t o = tiempo que necesita la fase móvil para llegar al detector desde el inicio de la columna t r = tiempo de retención t r = tiempo relativo = t r - t m
27 Fracción de analito en la fase móvil q = fracción de analito en la fase móvil moles m q = = moles s + moles m C m V m C m V m + C s V s q = C sv s C m V m q = K V s V m K V s V m = factor de capacidad = k
28 k' = ( t R - t o ) / t o Es la relación entre el tiempo que las moléculas del analito están en la fase estacionaria y el que están en la fase móvil. tiempo que el soluto pasa en la FE C V S S k tiempo que el soluto pasa en la FM C m V m k'= ß K D k'= ß D t R = t 0 (1 + K') ß = Vs/Vm
29 volumen que ocupa en la columna la FM V 0 = t 0 F V= tf volumen de FM necesario para que se produzca la elución de un soluto V R = t R F V' R = t' R F k' = V' R /V' 0 V R = V' R + V 0 V R = V 0 (1 + k')
30 La longitud de una columna en la que el soluto experimenta un equilibrio completo entre las dos fases Eficiencia de una separación cromatográfica número de platos teóricos (N) altura del plato teórico (H) N = L/H Altura del plato téorico reducida h= H/dp 4 a 10 buena columna La eficiencia de la columna aumenta cuanto mayor es el número de platos teóricos y menor la altura del mismo.
31 Una columna cromatográfica es más eficaz cuando menor sea el ensanchamiento de banda que genera. N = t R2 / t 2 N = 16 t R2 / W b 2 N = 4 t R2 / W i 2 = 5,54 t R2 / W h 2 N = 41,7 (t A B R / W 1 ) 0, 1,25 2
Juan Rolando Vázquez Miranda
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