CAPÍTULO V INTRODUCCIÓN A LAS SEPARACIONES CROMATOGRAFICAS

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1 CAPÍTULO V INTRODUCCIÓN A LAS SEPARACIONES CROMATOGRAFICAS Capítulo V Introducción a las Separaciones Cromatográficas 1

2 INTRODUCCIÓN A LAS SEPARACIONES CROMATOGRÁFICAS La cromatografía es uno de los métodos físicos generales, que más ampliamente se emplean para aislar los componentes de una mezcla dada. La separación de los mismos se basa en las diferencias que presentan sus respectivos coeficientes de distribución entre dos fases inmiscibles. Una de esas fases circula (fase móvil) y la otra está fija o estática (fase estacionaria) En todas las separaciones cromatográficas, la muestra se disuelve en una fase móvil, que puede ser un gas, un líquido o un fluido supercrítico. Esta fase móvil se hace pasar a través de una fase estacionaria inmiscible, la cual se mantiene fija en una columna o sobre una superficie sólida. Las dos fases se eligen de tal forma, que los componentes de la muestra se distribuyen de modo distinto entre la fase móvil y la fase estacionaria. La velocidad de migración es función de la distribución que se produzca en el equilibrio: si los componentes se distribuyen más fácilmente en la fase estacionaria, migrarán más lentamente por la columna cromatográfica. Aquellos componentes que son retenidos con fuerza por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase móvil; por el contrario, los componentes que se unen débilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas discriminadas que pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente. Los fenómenos físicos que influyen directamente sobre las constantes de equilibrio de distribución entre ambas fases son entre otros: absorción o partición, adsorción e intercambio iónico. Clasificación de los métodos cromatográficos Los métodos cromatográficos se pueden clasificar de dos modos distintos: a) según la forma en que las fases estacionaria y móvil se ponen en contacto. cromatografia en columna: la fase estacionaria se mantiene dentro de un tubo estrecho a través del cual se hace pasar la fase móvil por presión o por gravedad. cromatografia plana: la fase estacionaria se mantiene sobre una placa lisa o en los intersticios de un papel; la fase móvil se desplaza a través de la fase estacionaria por capilaridad o por gravedad. b) según el tipo de fase móvil y estacionaria, y en la clase de equilibrios implicados en la transferencia de los solutos entre las fases. La Tabla 1 relaciona tres clases generales de cromatografía: cromatografía de líquidos, cromatografía de gases y cromatografía de fluidos supercríticos. Como su nombre indica, las fases móviles en las tres técnicas son, respectivamente, líquidos, gases y fluidos supercríticos. Como se indica en la columna 2 de la tabla, las dos primeras clases generales incluyen varios métodos cromatográficos. Solamente la cromatografía de líquidos es la que puede realizarse en columnas o sobre superficies planas; por otra parte, la cromatografía de gases y la de fluidos supercríticos están restringidas a los procedimientos en columna. Capítulo V Introducción a las Separaciones Cromatográficas 2

3 TABLA 1. Clasificación de los métodos cromatográficos Clasificación general Método específico Fase estacionaria Tipo de equilibrio Líquido-líquido, o reparto Líquido adsorbido o unido a una superficie sólida Reparto entre líquidos inmiscibles Líquido-sólido, o Cromatografía de adsorción Sólido Adsorción líquidos Intercambio iónico Resina de intercambio iónico Intercambio iónico (LC) Líquido en los intersticios de Exclusión por tamaño Fase móvil: líquida un sólido polimérico Reparto/ tamizado Líquido con un grupo Reparto entre un Afinidad específico unido a una superficie sólida líquido superficial y líquido móvil Cromatografía de gases (GC) Fase móvil: gas Cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) Fase móvil: fluido supercrítico Gas-líquido Líquido adsorbido o unido a una superficie sólida Gas-sólido Sólido Adsorción Especies orgánicas unidas a una superficie sólida Reparto entre un gas y un líquido Reparto entre un fluido supercrítico y una superficie unida La Figura 1 muestra esquemáticamente cómo dos sustancias A y B se separan en una columna por cromatografía de elución. La elución implica el transporte de una especie a través de una columna por la adición continua de nueva fase móvil. Como se indica en la figura, una porción de la muestra, contenida en la fase móvil, se introduce en la parte superior de la columna (tiempo t o en la Figura 1) y a continuación los componentes de la misma se distribuyen entre las dos fases. La introducción de fase móvil adicional (el eluyente) hace que la fase móvil que contiene una parte de la muestra se mueva hacia abajo por la columna, donde tiene lugar un posterior reparto entre la fase móvil y las porciones nuevas de fase estacionaria (tiempo t i ). Al mismo tiempo, tiene lugar una distribución entre el disolvente nuevo y la fase estacionaria en el lugar en que inicialmente se ubicaba la muestra. Sucesivas adiciones de fase móvil hacen descender las moléculas de analito por la columna en una serie continua de transferencias entre las fases estacionaria y móvil. Sin embargo, debido a que el movimiento de los componentes de la muestra sólo puede ocurrir en la fase móvil, la velocidad promedio con la que la especie migra depende de la fracción de tiempo que reside en esta fase. Esta fracción es pequeña para las sustancias que son retenidas fuertemente por la fase estacionaria (por ejemplo, el compuesto B en la Figura 1) y es grande cuando es más probable la retención en la fase móvil (componente A). La diferencia de velocidad que resulta hace que se separen los componentes de la mezcla en dos bandas, o zonas, que se extienden a lo larga de la columna (ver tiempo t 2 en la Figura 1). Capítulo V Introducción a las Separaciones Cromatográficas 3

4 Muestra Fase móvil A + B Columna de relleno Señal del detector t 0 t 1 t 2 t 3 t 4 Detector Fig 1: (a) Diagrama que muestra la separación de una mezcla de componentes A y B por cromatografía de elución en columna (b) Salida de la señal del detector en las diversas fases de la elución A B t 0 t 1 t 2 t 3 t 4 Tiempo Luego que el analito llega al detector, se representa su señal en función del tiempo (o del volumen de fase móvil añadido), de esta manera se obtienen una serie de picos (como se muestra en la parte inferior de la Figura 1); obteniendo un gráfico denominado cromatograma, el cual es útil tanto para el análisis cualitativo como cuantitativo. Parámetros cromatográficos: Velocidad de migración de las especies: La efectividad de una columna cromatográfica para separar dos analitos depende, en parte, de las velocidades relativas con las que eluyen las dos especies. Esas velocidades están determinadas por la magnitud de las constantes de los equilibrios de distribución de las especies entre las fases estacionaria y móvil. a. Constante de distribución (K): Los equilibrios de distribución implicados en cromatografía se describen por ecuaciones que suponen la transferencia de un analito entre las fases estacionaria y móvil. Así, para la especie analito A, se puede escribir A móvil A estacionaria La constante K para este equilibrio se denomina constante de distribución, razón de distribución o coeficiente de distribución, y se expresa como: K= C s / C M C s: es la concentración molar del analito en la fase estacionaria C M: es la concentración molar del analito en la fase móvil Idealmente, el coeficiente de distribución es constante en un amplio intervalo de concentraciones; de este modo, C s es directamente proporcional a C M. La cromatografía en la que es aplicable la ecuación anterior, se denomina cromatografía lineal. b. Tiempo de retención (t R ): es el tiempo que transcurre desde de la inyección de la muestra hasta que el pico del analito alcance el detector. En la figura 2 se denomina tiempo muerto (t M ), al tiempo que emplea la fase móvil para llegar al detector. La velocidad de migración de la especie no retenida coincide con la velocidad promedio del movimiento de las moléculas de la fase móvil. Capítulo V Introducción a las Separaciones Cromatográficas 4

5 La velocidad lineal media de la migración del analito es: donde L es la longitud del relleno de la columna. De manera semejante, la velocidad lineal media del movimiento u de las moléculas de la fase móvil es: u = L / t M t R t M Tiempo Fig 2: Cromatograma característico de una mezcla de dos componentes. El pico pequeño de la izquierda representa una especie que no se retiene en la columna y alcanza el detector inmediatamente después de la elución. c. La velocidad de migración del soluto; factor de retención (k ): Se utiliza para describir las velocidades de migración de los analitos en las columnas. Para una especie A, el factor de capacidad k A está relacionado con la velocidad a la cual A migra a través de una columna. Es la cantidad de tiempo que pasa un soluto en la fase estacionaria en relación con el tiempo que pasa en la fase móvil. Se expresa como: k A = K A V S o k = t r t M V M t M donde t R y t M se pueden obtener a partir de un cromatograma. Cuando el factor de capacidad para una especie es mucho menor que la unidad, la elución tiene lugar tan rápidamente que es difícil determinar con exactitud los tiempos de retención. Cuando el factor de capacidad es del orden de 20 a 30 o tal vez mayor, los tiempos de retención son demasiado largos. Idealmente, las separaciones se realizan en unas condiciones en las que los factores de capacidad para las especies de una mezcla oscilan entre 1 y 5. d. Velocidad de migración diferencial; factor de selectividad ( ): Proporciona una medida de la eficacia con la cual la columna puede separar los analitos. El factor de selectividad de una columna para dos especies A y B se expresa como: = K B K A donde K B es la constante de distribución para la especie más fuertemente retenida B, y K A es la constante de distribución para la menos retenida, la especie A, (o que eluye con más rapidez). Con esta definición siempre es mayor que la unidad. Existe una relación entre el factor de selectividad para dos analitos y sus factores de capacidad: = (t R ) B t M o = k B (t R ) B t M k A Donde k B y k A son los factores de capacidad de B y A, respectivamente. Reordenando ambas expresiones, resulta una ecuación que permite la determinación de Capítulo V Introducción a las Separaciones Cromatográficas 5

6 a partir de un cromatograma experimental: Ensanchamiento de banda: = (k ) B - t M (k ) A - t M La teoría cinética, o de la velocidad, de la cromatografía explica en términos cuantitativos las formas de los picos y los efectos de distintas variables en la anchura de los mismos. Resulta bueno considerar la conducta de una partícula individual del analito, la cual, durante la migración, experimenta miles de transferencias entre las fases estacionaria y móvil. El tiempo que pasa en cada fase después de una transferencia es muy irregular, y depende de que gane accidentalmente la suficiente energía térmica del medio para que se produzca la transferencia inversa y de la afinidad que tenga con la fase estacionaria quedando allí retenida más tiempo y tardando más tiempo en pasar a la fase móvil, y al final de la columna, llegar al detector. La anchura de una banda aumenta a medida que se mueve a través de la columna, debido a que cuanto más tiempo transcurre mayor es la dispersión que puede tener lugar. Por ello, la anchura de la zona está relacionada directamente con el tiempo de residencia en la columna, e inversamente con la velocidad a la que fluye la fase móvil. Eficiencia de la columna: Dos términos afines se utilizan con frecuencia como medidas cuantitativas de la eficiencia de una columna cromatográfica: a) la altura de plato H y b) el número de platos teóricos N. Los dos están relacionados por la ecuación: N = L/H donde L es la longitud (normalmente en centímetros, si es cromatografía líquida y en metros si es cromatografía gaseosa) del relleno de la columna. La eficiencia de la columna cromatográfica aumenta cuanto mayor es el número de platos teóricos y cuanto menor es la altura de platos teóricos Relación entre la altura de plato y las variables que afectan la eficiencia de la columna: La eficiencia de las columnas cromatográficas puede evaluarse por la expresión: H = B/u + C s u + C M u (1) ó H = A + B/u + Cu (Ecuación de Van Demmter) donde H es la altura de plato en centímetros y u es la velocidad lineal de la fase móvil en centímetros por segundo. Las magnitudes A, B y C son constantes, que se relacionan con las propiedades de la columna y del analito. A= coeficiente de difusión aparente o de caminos múltiples B= coeficiente de difusión longitudinal C= coeficiente de difusión por transferencia de masa 1. Difusión aparente o caminos múltiples (A): es ocasionada por la multitud de caminos de diferente longitud, creados dentro del empaque de la columna. Así, dependiendo del camino tomado por las partículas, éstas llegan al final de la columna a diferentes tiempos por cual ensanchan los picos cromatográficos. Aumenta este factor al aumentar el flujo de la fase móvil. 2. Difusión longitudinal (B/u): Es una causa del ensanchamiento de banda por la que los analitos difunden desde la zona más concentrada en el centro de la banda hacia las regiones más diluidas por delante y por detrás del centro de la banda es decir, en el mismo sentido y en el opuesto a la dirección del flujo de la fase móvil. La contribución de la difusión longitudinal resulta ser inversamente proporcional a la velocidad de la fase móvil. Esta correlación no es sorprendente puesto que, cuanto Capítulo V Introducción a las Separaciones Cromatográficas 6

7 más alto es el caudal, más breve es el periodo de tiempo que el analito reside en la columna. Así, la difusión desde el centro de la banda hacia los extremos tiene menos tiempo para poder producirse. 3. Coeficientes de transferencia de masa (C S y C M ): La necesidad de introducir las dos constantes de transferencia de masa C S y C M en la ecuación (1), se debe a que el analito requiere un cierto tiempo para transferirse entre las fases móvil y estacionaria. Cuando el caudal es demasiado rápido, no puede alcanzarse el equilibrio. Optimización de la eficiencia de una columna: Una separación cromatográfica se optimiza variando las condiciones experimentales hasta que los componentes de una mezcla se separan totalmente en el menor tiempo posible. Los experimentos de optimización tienen como objetivo bien (a) reducir el ensanchamiento de zona, o bien (b) modificar las velocidades relativas de migración de los componentes. Las variables cinéticas que incrementan la altura de plato de una columna producen un ensanchamiento de banda. Por otra parte, las velocidades de migración son modificadas por aquellas variables que afectan a los factores de capacidad y selectividad de la solución. e. Resolución de la columna: La resolución R S de una columna constituye una medida cuantitativa de su capacidad para separar dos analitos. Se expresa como: R S = 2 [(t R ) B (t R ) A ] W A + W B A partir de la figura 3 se observa que una resolución de 1,5 permite una separación esencialmente completa de los dos componentes, mientras que no es así con una resolución de 0,75. Con una resolución de 1,0 la zona de A contiene aproximadamente un 4 % de B, y la zona de B contiene una cantidad similar de A. Con una resolución de 1,5 el solapamiento es del orden de un 0,3 %. Para una fase estacionaria dada, la resolución puede mejorarse alargando la columna, aumentando así el número de platos. Sin embargo, una consecuencia adversa del aumento del número de platos es un aumento del tiempo necesario para la separación. Fig. 3: Separaciones correspondientes a tres resoluciones distintas Capítulo V Introducción a las Separaciones Cromatográficas 7

8 Aplicaciones de la cromatografía La cromatografía ha pasado a ser el principal método para la separación de especies químicas estrechamente relacionadas entre sí. Además, se puede emplear para la identificación cualitativa y para la determinación cuantitativa de las especies separadas. Se considerarán algunas de las características generales de la cromatografía como una herramienta para el análisis. - Análisis cualitativo: Un cromatograma proporciona sólo una parte de la información cualitativa correspondiente a las especies de la muestra a saber, su tiempo de retención o su posición en la fase estacionaria tras un cierto período de elución. Se emplea para reconocer la presencia o ausencia de componentes en mezclas que contengan un número limitado de posibles especies de las que se conozca su identidad. Por ejemplo, si en la muestra no aparece un pico con el mismo tiempo de retención que el estándar en las mismas condiciones, se puede asumir que el compuesto en cuestión está ausente (o está presente a una concentración por debajo del límite de detección del procedimiento). - Análisis cuantitativo: La cromatografía debe su crecimiento espectacular durante las pasadas cuatro décadas en parte a su rapidez, simplicidad, bajo costo, y a su gran aplicabilidad como herramienta de separación. La cromatografía en columna cuantitativa se basa en la comparación de la altura, o del área, del pico del analito con la de uno o más estándares. En cromatografía plana, el área cubierta por las especies separadas sirve como parámetro analítico. Si se controlan las condiciones adecuadamente, esos parámetros varían linealmente con la concentración. Análisis basados en las áreas de pico El área de pico es independiente de los efectos del ensanchamiento. Desde este punto de vista, las áreas son un parámetro analítico más adecuado que las alturas de pico. Los instrumentos cromatográficos más modernos están equipados con integradores electrónicos digitales, los cuales permiten una precisa estimación de las áreas de pico. Calibración y patrones El método más sencillo para el análisis cromatográfico cuantitativo implica la preparación de una serie de disoluciones de patrón de composición igual a la de la muestra. A continuación se obtienen los cromatogramas de los patrones y se representan las alturas o áreas de pico en función de la concentración. La representación de los datos debería originar una línea recta que pasara por el origen de coordenadas; los análisis se basan en esta gráfica. Para una mayor exactitud es necesaria una reestandarización frecuente. El método del estándar interno En cromatografía cuantitativa la mayor precisión se consigue por el uso de patrones internos debido a que se evitan las incertidumbres que se introducen en la inyección de la muestra. En este procedimiento, se introduce en cada estándar y en la muestra una cantidad exactamente medida de una sustancia estándar interno, y la relación de las áreas (o alturas) del analito y del estándar interno sirve como parámetro analítico. Para poder aplicar este método, es necesario que el pico del estándar interno esté bien separado de los picos de los demás componentes de la muestra (R S > 1,5); por otra parte, el pico del estándar debería aparecer cerca del pico del analito. Con un estándar interno adecuado, se pueden conseguir precisiones mejores que el 1 % relativo. Capítulo V Introducción a las Separaciones Cromatográficas 8

9 El método de la normalización de áreas Otro procedimiento que evita las incertidumbres asociadas con la inyección de la muestra es el método de la normalización de áreas. Se requiere la elución completa de todos los componentes de la muestra. En el método de la normalización, se determinan las áreas de todos los picos eluidos; tras corregir esas áreas debido a las diferencias en la respuesta del detector a los distintos tipos de compuestos, la concentración del analito se calcula por la relación de su área con el área total de los picos. Resumen de las ecuaciones de interés en cromatografía El número de parámetros, términos y ecuaciones que se emplean en cromatografía es grande y a menudo confuso. En las tablas 2 y 3 se resumen las ecuaciones y definiciones más importantes que se utilizarán. TABLA 2. Parámetros cromatográficos experimentales, símbolos y su forma de determinación Símbolo del Determinación Nombre parámetro Experimental Tiempo de migración, especies no retenidas t M Cromatograma Tiempos de retención, especies A y B (t R ) A, (t R ) B Cromatograma Tiempo de retención ajustado especie A (t R ) A (t R ) B = (t R ) A / t M Anchuras de pico, especies A y B W A, W B Cromatograma Longitud del relleno de columna L Medida directa Caudal F Medida directa Volumen de la fase estacionaria Datos de preparación Concentración del analito en la fase móvil y estacionaria V S C M, C S del relleno Datos del análisis y de la preparación TABLA 3. Nombre, cálculo y relaciones entre parámetros Nombre Cálculo Relación con otros parámetros Velocidad lineal de la fase móvil: Volumen de fase móvil: Factor de capacidad, o razón de reparto: Coeficiente de distribución: Factor de selectibidad : Resolución: Capítulo V Introducción a las Separaciones Cromatográficas 9

10 Número de platos: Altura del plato: Tiempo de retención: Volumen de retención: CROMATOGRAFÍA GASEOSA (GC) En la cromatografía de gases, los componentes de una muestra vaporizada se separan como consecuencias de su reparto entre una fase móvil gaseosa y otra fase estacionaria líquida o sólida mantenida en una columna. La muestra se vaporiza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatográfica. La elución se logra mediante el flujo de una fase móvil de gas inerte. Son dos tipos de cromatografía de gases, la cromatografía gas - líquido y la cromatografía gas - sólido. La primera es de amplio uso y suele abreviarse GC y se basa en el reparto del analito entre una fase móvil gaseosa y una fase líquida inmovilizada sobre la superficie de un sólido inerte o en las paredes del tubo capilar. Los componentes básicos de un instrumento de GC característico se describirán a continuación: Gas portador Entre los gases portadores, que deben ser químicamente inertes, se encuentran el helio, argón, nitrógeno, dióxido de carbono y el hidrógeno. Como se indicará posteriormente, la elección del gas está con frecuencia determinada por el tipo de detector que se utiliza. Con el suministro del gas se encuentran asociados los reguladores de presión, manómetros y medidores de flujo. Además, el sistema de gas portador contiene generalmente un tamiz molecular para eliminar el agua u otras impurezas. Fig. 4: Representación esquemática de un cromatógrafo de gases. Capítulo V Introducción a las Separaciones Cromatográficas 10

11 Sistema de inyección de muestra La eficacia de la columna requiere que la muestra sea de un tamaño adecuado y que sea introducida como un tapón de vapor; la inyección lenta de muestras demasiado grandes provoca un ensanchamiento de las bandas y una mala resolución. El método más común de inyección de muestra implica el uso de una microjeringa para inyectar una muestra líquida o gaseosa a través de un diafragma o septum de goma de silicona, en una cámara de vaporización instantánea situada en la cabeza de la columna (la cámara de muestra normalmente está a 50 C por encima del punto de ebullición del componente menos volátil de la muestra). Para las columnas analíticas ordinarias, el tamaño de muestra varía desde unas pocas décimas de microlitro a 20µL. las columnas capilares exigen muestras mucho menores ( 10-3 L); en estos casos se emplea un divisor de la muestra que permite pasar a la columna solamente una pequeña fracción de la muestra, desechándose el resto. Configuraciones de columna y hornos Las columnas cromatográficas varían desde menos de 2 a 50 m, o más. Se construyen de acero inoxidable, vidrio, sílice fundida, o teflón. A fin de poder colocarse en el interior de un termostato, normalmente se configuran como helicoides con diámetros de 10 a 30 cm. La temperatura de la columna es una variable importante que para un trabajo preciso ha de regularse a las décimas de grado, por ello la columna normalmente se introduce dentro de un horno termostatizado. La temperatura óptima de la columna depende del punto de ebullición de la muestra y del grado de separación requerido. En la práctica, con una temperatura igual o ligeramente superior al punto de ebullición promedio de la muestra, se obtienen tiempos de elución razonables (2 a 30 min). Para muestras con un amplio intervalo de ebullición, a menudo es conveniente emplear una programación de temperatura, con lo que se aumenta la temperatura de la columna bien de forma continua, bien por etapas, al mismo tiempo que tiene lugar la separación. En general, la resolución óptima se asocia con una menor temperatura; sin embargo, la consecuencia de una reducción de temperatura es un aumento en el tiempo de elución, y por tanto del tiempo que se necesita para completar un análisis. Es importante que todas las partes del cromatógrafo gaseoso mantengan una temperatura bastante elevada, para mantener la muestra al estado gaseoso (volátil). El puerto de inyección de muestra (septum) es el que está a mayor temperatura para volatilizar rápidamente la muestra. En cromatografía de gases se usan dos tipos generales de columnas: a) las empaquetadas o de relleno: Las actuales columnas de relleno se fabrican con tubo de vidrio, metal (acero inoxidable, cobre, aluminio), o de Teflón, con una longitud característica de 2 a 3 m y un diámetro interno de 2 a 4 mm. b) las tubulares o capilares: Las columnas capilares de sílice más frecuentemente utilizadas tienen diámetros internos de 320 y 250 m. También se venden columnas de alta resolución, con diámetros de 200 y 150 m. La utilización de estas columnas es más problemática y son más exigentes con respecto a los sistemas de detección y de inyección. Por ejemplo, se ha de utilizar un divisor de muestra para reducir el tamaño de la muestra inyectada en la columna, y se requiere un sistema de detección más sensible con un tiempo de respuesta rápido. Recientemente, han aparecido en el mercado capilares de 530 m, a veces llamados columnas macrocapilares, las cuales admiten muestras de tamaño similar a los empleados en las columnas de relleno. Las características de las columnas macrocapilares no son tan buenas como las columnas de menor diámetro, pero son significativamente mejores que en las columnas de relleno Detectores En cromatografía de gases, un detector ideal tiene las siguientes características: Capítulo V Introducción a las Separaciones Cromatográficas 11

12 1. Adecuada sensibilidad. Lo que constituye una adecuada sensibilidad no se puede evaluar de forma cuantitativa. Por ejemplo, las sensibilidades de los detectores que se van a describir difieren por un factor Aunque todos se utilizan extensamente y son adecuados en ciertos casos; sin embargo, en algunas aplicaciones los menos sensibles no resultan convenientes. En general, las sensibilidades de los detectores actuales se encuentran en el intervalo de 10-8 a g de analito/s. 2. Buena estabilidad y reproducibilidad. 3. Una respuesta lineal para los analitos que se extiendan a varios órdenes de magnitud. 4. Un intervalo de temperaturas de trabajo comprendido desde la temperatura ambiente hasta al menos 400 ºC. 5. Un tiempo de respuesta corto que lo haga independiente del caudal. 6. Alta fiabilidad y manejo sencillo. Hasta el punto de estar a prueba de la impericia de operadores inexpertos. 7. Respuesta semejante para todos los analitos, o por el contrario, una respuesta selectiva y altamente predecible para una o más clases de analitos. 8. No destructivo de la muestra. De hecho, no hay detector que reúna todas las características, y tampoco parece probable que pueda llegar a diseñarse nunca. Se describirán los utilizados más frecuentemente. a) De ionización de llama: (FID) es uno de los más extensamente utilizados. Es insensible a los gases no combustibles como H 2 O, CO 2, SO 2 y NO 2. Se usa para el análisis de la mayoría de compuestos orgánicos, incluyendo aquellos que están contaminados con agua y con óxidos de nitrógeno y de azufre. Posee una elevada sensibilidad ( g/s), un gran intervalo lineal de respuesta ( 10 7 ), y un bajo ruido. Por lo general, es resistente y fácil de utilizar. Una desventaja es que es destructivo de la muestra. b) De conductividad térmica (TCD): Uno de los primeros detectores que se utilizaron en cromatografía de gases, y uno de los que todavía tiene una gran aplicación, se basa en los cambios en la conductividad térmica de la corriente de gas ocasionados por la presencia de las moléculas de analito. Las conductividades térmicas del helio y del hidrógeno son aproximadamente de seis a diez veces mayores que las de la mayoría de los compuestos orgánicos, de modo que, incluso en presencia de pequeñas cantidades de materia orgánica, tiene lugar una disminución relativamente grande de la conductividad térmica del efluente de la columna y, en consecuencia, el detector experimenta un marcado aumento en la temperatura. Las conductividades de los otros gases portadores son parecidas a las de los constituyentes orgánicos y por esta razón con un detector de conductividad térmica debe usarse hidrógeno o helio como gas portador. Las ventajas son su simplicidad, su amplio rango dinámico lineal ( 10 5 ), su respuesta universal tanto a especies orgánicas como a inorgánicas y su carácter no destructivo, lo que permite recoger los solutos tras la detección. Una limitación es su sensibilidad relativamente baja ( 10-8 g de soluto/ml de gas portador). Otros detectores son de 10 4 a 10 7 veces más sensibles. Debería subrayarse que la baja sensibilidad, hace imposible con frecuencia su utilización con columnas capilares, debido al pequeño tamaño de muestra con el que estas columnas operan. c) Termoiónico (TID): es un detector selectivo de los compuestos orgánicos que contienen fósforo y nitrógeno. Su respuesta a un átomo de fósforo es aproximadamente 10 veces mayor que a un átomo de nitrógeno, y de 10 4 a 10 6 veces superior que a un átomo de carbono. En comparación con el detector de ionización de llama, el detector termoiónico es unas 500 veces más sensible para los compuestos que contienen fósforo y unas 50 veces más sensible a las especies nitrogenadas. Estas propiedades Capítulo V Introducción a las Separaciones Cromatográficas 12

13 hacen de la detección termoiónica un sistema particularmente útil para la detección y determinación de muchos pesticidas que contienen fósforo. d) De captura de electrones: (CE) El detector de captura de electrones es de gran respuesta selectiva, siendo muy sensible a las moléculas que contienen grupos funcionales electronegativos tales como halógenos, peróxidos, quinonas; en cambio, no es sensible a grupos funcionales como aminas, alcoholes e hidrocarburos. Una aplicación importante es la detección y determinación de insecticidas clorados. e) Fotométrico: Es selectivo y muy sensible a los compuestos que contienen azufre y fósforo, se ha utilizado extensamente para el análisis de contaminantes del aire y del agua como los pesticidas y los hidrocarburos. CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) Existen cuatro tipos básicos de cromatografía en los que la fase móvil es un líquido: (1) cromatografía de reparto; (2) cromatografía de adsorción, o líquido-sólido; (3) cromatografía iónica; (4) cromatografía de exclusión por tamaños, o en geles. En las primeras etapas del desarrollo de la cromatografía de líquidos, los científicos se dieron cuenta que se podían conseguir grandes aumentos en la eficacia de la columna disminuyendo el tamaño de las partículas de los rellenos. Sin embargo, no fue sino hasta finales de los años sesenta cuando se desarrolló la tecnología adecuada para producir y utilizar rellenos de tamaño de partícula del orden de los 3 o 10 m. Esta tecnología requiere una instrumentación sofisticada, que contrasta con las simples columnas de vidrio de la cromatografía de líquidos clásica. Con objeto de alcanzar un caudal de eluyente razonable con rellenos de tamaño de partícula entre 3 y 10 m, que, por otra parte, son comunes en la moderna cromatografía de líquidos; se requieren presiones de algunos cientos de kilos por centímetro cuadrado. Como consecuencia de estas elevadas presiones, el equipo necesario para la HPLC tiende a ser más sofisticado y caro que el que se utiliza en otros tipos de cromatografía. La Figura 5 muestra un esquema de los componentes fundamentales de un cromatógrafo de líquidos de alta resolución típico. Fig. 5: Esquema de un equipo de HPLC Capítulo V Introducción a las Separaciones Cromatográficas 13

14 Fase,móvil: Los disolventes más usados son: hexano, cloruro de metileno, isopropanal, cloroformo, acetonitrilo, metanal, agua. Un aparato moderno de HPLC se equipa con uno o más recipientes de vidrio o de acero inoxidable, cada uno de los cuales contiene unos 500 ml de un disolvente. Los recipientes a menudo se equipan con un sistema para eliminar los gases disueltos -en general oxigeno y nitrógeno- que interfieren formando burbujas en los sistemas de detección. Un desgasificador puede consistir en un sistema de bombeo por vacío. Con frecuencia estos sistemas también contienen un dispositivo para la filtración del polvo y de las partículas sólidas en suspensión de los disolventes. Por ejemplo, una forma conveniente de tratar los disolventes antes de introducirlos en el recipiente, consiste en filtrarlos mediante el vacío a través de un filtro de poro muy pequeño. Este tratamiento elimina los gases además de la materia en suspensión. Una separación que utiliza un solo disolvente de composición constante se denomina una - elución isocrática. Con frecuencia, la eficiencia de la separación se aumenta notablemente por una elución con gradiente. En este caso se utilizan dos (y a veces más) disolventes con una polaridad significativamente distinta. Una vez que comienza la elución, se varía la relación de los disolventes de forma programada, a veces continuamente y a veces mediante una serie de etapas escalonadas. Los instrumentos modernos de HPLC están equipados con unos dispositivos que permiten introducir los disolventes desde dos o más recipientes en una cámara de mezcla a una velocidad que varia continuamente y la relación de volumen de los disolventes se puede modificar lineal o exponencialmente con el tiempo. La elución con gradiente acorta notablemente el tiempo de separación sin sacrificar la resolución de los primeros picos. También tiene efectos similares a los producidos por la programación de temperaturas en cromatografía de gases. Bombas: Se utilizan tres tipos de bombas, cada una con sus propias ventajas y desventajas: bombas recíprocas, bombas de jeringa o de desplazamiento y bombas neumáticas o de presión constante. Generalmente se usan las recíprocas o de pistón que desplazan flujos de volumen constante en forma. Inyección de muestra A menudo, el factor limitante en la precisión de las medidas en cromatografía de líquidos es la reproducibilidad con que se puede introducir la muestra en la columna. El problema se agrava por el ensanchamiento de banda que acompaña a la sobrecarga de las columnas. Por ello, los volúmenes que se emplean han de ser muy pequeños - de unas pocas décimas de microlitro, a tal vez 500 m. Además, se ha de poder introducir la muestra sin despresurizar el sistema. El método más ampliamente utilizado para la introducción de la muestra es con bucles. Estos dispositivos están normalmente integrados en el equipo cromatográfico y hay bucles intercambiables que permiten la elección de tamaños de muestra desde 5 a 500 m, a presiones de hasta 7000 psi con una precisión relativa de unas décimas por ciento. También existen válvulas de inyección de micromuestras, con bucles con volúmenes de 0,5 a 5 m. Columnas : Las columnas son generalmente de acero inoxidable de diámetro interno uniforme, aunque en algunas ocasiones se encuentran tubos de vidrio de paredes resistentes. Estas últimas sólo se utilizan a presiones menores de unos 600 psi., tienen una longitud entre 10 y 30 cm. Por lo común, las columnas son rectas y se pueden alargar, si es necesario, acoplando dos o más columnas. Los típicos reilenos de partículas porosas están formados por micropartículas porosas con diámetro entre 3 y 10 m. Las partículas son de sílice, alúmina o de una resina de intercambio Capítulo V Introducción a las Separaciones Cromatográficas 14

15 iónico, aunque la sílice es el material más común se recubren muchas veces con películas orgánicas, que se unen química o físicamente a la superficie. Precolumnas: En muchas ocasiones, para aumentar la vida de la columna analítica, se coloca delante una precolumna que elimina la materia en suspensión y los contaminantes de los disolventes. Termostatos: En muchas aplicaciones no se necesita un control estricto de la temperatura, y las columnas trabajan a temperatura ambiente. Sin embargo, muchas veces si se controla la temperatura de la columna en unas pocas décimas de grado centígrado, se obtienen mejores cromatogramas. La mayoría de los instrumentos comerciales llevan actualmente hornos para las columnas que controlan la temperatura de la columna a las décimas de grado, desde la temperatura ambiente hasta 150 C. Detectores: A diferencia de la cromatografía de gases, en la cromatografía de líquidos no hay detectores tan aplicables universalmente ni tan fiables como los detectores de ionización de llama y de conductividad térmica. Uno de los mayores retos en el desarrollo de la cromatografía de líquidos ha sido el perfeccionamiento de los detectores. Un detector ideal para cromatografía de líquidos debería poseer todas las propiedades listadas en relación con la cromatografía de gases, con la excepción de que un detector para cromatografía de líquidos no es necesario que sea sensible en un intervalo tan grande de temperaturas. Además, debe tener un volumen interno mínimo a fin de reducir el ensanchamiento de banda. Los detectores son de dos tipos Los detectores basados en una propiedad de la disolución: responden a una propiedad de la fase móvil, tal como el índice de refracción, la constante dieléctrica, o la densidad, que se modifican por la presencia de los analitos. Los detectores basados en una propiedad del soluto: responden a algunas propiedades del soluto, como la absorbancia UV, fluorescencia, o intensidad de difusión, que no son propias de la fase móvil. a) Detectores de ultravioleta : Los detectores de absorción UV más simples son los fotómetros de filtros con una lámpara de mercurio como fuente. Lo más común en estos casos es aislar la línea intensa a 254 nm por medio de filtros; en algunos equipos también se pueden utilizar las líneas a 250, 313, 334 y 365 nm empleando otros filtros, que este tipo se utiliza de forma restringida para aquellos solutos que absorben a alguna de estas longitudes de onda. Como se ha indicado algunos grupos funcionales orgánicos y diversas especies inorgánicas exhiben una banda ancha de absorción a una o más de esas longitudes de onda. b) Detectores de fluorescencia:una ventaja inherente es su alta sensibilidad, que resulta ser más de un orden de magnitud mayor que la de los sistemas de absorbancia. Se ha aprovechado esta ventaja para la separación y determinación de los componentes fluorescentes de las muestras. relacionados con el análisis de materiales farmacéuticos, productos naturales, muestras clínicas y productos del petróleo. c) Detectores de índice de refracción: Tienen la ventaja de que responden a casi todos los solutos. Es decir, son detectores universales análogos a los detectores de llama en cromatografía de gases. Además son fiables y no dependen del caudal. Sin embargo, son muy sensibles a los cambios de temperatura y se han de mantener a una temperatura constante en unas pocas milésimas de grado centígrado. Por otra parte, no son tan sensibles como la mayoría de los otros detectores y por lo general no se pueden utilizar en la elución con gradiente. d) Detectores electroquímicos: Los fabricantes de instrumentos proporcionan en la actualidad varios tipos de detectores electroquímicos que se basan en la oxidación o Capítulo V Introducción a las Separaciones Cromatográficas 15

16 reducción de 16 grupos funcionales orgánicos. Por tanto, la detección electroquímica parece poder cubrir una necesidad que largo tiempo ha tenido la HPLC, que es la de disponer de un detector general o universal sensible. Aplicación de HPLC Es incuestionable que la cromatografía de líquidos de alta resolución es la técnica de separación más ampliamente utilizada. Las razones son su sensibilidad, su fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separación de especies no volátiles o termolábiles y, sobre todo, su gran aplicabilidad a sustancias que son de primordial interés en la industria, en muchos campos de la ciencia y para la sociedad en general. Algunos ejemplos de estos materiales incluyen los aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, drogas, terpenoides, plaguicidas, antibióticos esteroides, especies organometálicas y una cierta variedad de sustancias inorgánicas. Capítulo V Introducción a las Separaciones Cromatográficas 16

17 GUÍA TEÓRICA INTRODUCCIÓN A LA SEPARACIONES CROMATOGRÁFICAS 1) Explique el fundamento de una técnica cromatográfica. 2) Complete el siguiente cuadro: Clasificación general Método específico Fase estacionaria Tipo de equilibrio Cromatografía de líquidos (LC) Fase móvil: líquida Cromatografía de gases (GC) Fase móvil: gas 3) Qué es una elución cromatográfica? 4) Qué es y para qué sirve un cromatograma? 5) Defina los siguientes términos: Constante de distribución: Tiempo de retención (t R ): Tiempo muerto (t m ): Capítulo V Introducción a las Separaciones Cromatográficas 17

18 Columnas Inyector FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Factor de retención o factor capacidad (k ): Factor de selectividad ( ): Resolución (Rs): 6) Complete el siguiente cuadro estableciendo las diferencias entre las diferentes técnicas cromatográficas: CROMATOGRAFÍA GASEOSA CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA Fase móvil Volumen de inyección Jeringas Temperatura Descripción Tamaño (long., diam. Interno) Fase estacionaria Temperatura Detectores Características de los analitos Aplicaciones Capítulo V Introducción a las Separaciones Cromatográficas 18

19 Introducción TRABAJO PRÁCTICO Nº 4 C R O M A T O G R A F Í A Las técnicas cromatrográficas son técnicas de separación. Tienen como finalidad la separación de mezclas de solutos que, disueltas en un solvente, son fraccionadas en sus distintos componentes, en función de la diferente afinidad de éstos por dos fases. La separación cromatográfica se produce entre dos fases: la fase móvil, un flujo líquido o gaseoso en el cual están los solutos que se van a separar, y la fase estacionaria, que es el lecho a través del cual va a fluir la fase móvil, la fase estacionaria puede ser un sólido inerte o una fina partícula de líquido que pinta la columna. Los distintos componentes de la mezcla se van a separar en función de su distribución entre la fase móvil y la fase estacionaria, en virtud de un proceso en equilibrio. De esta forma, un compuesto que tenga más afinidad que otro por la fase estacionaria, se retrasará en su avance a través de ésta más que aquel que tiene menor afinidad, que la atravesará antes. El reparto entre las fases se fundamenta en las diferencias físicas y/o químicas de los componentes de la muestra. Una vez que todos los componentes de la mezcla han atravesado la fase estacionaria, salen separados unos de otros, lo cual puede ser empleado con fines de identificación, cuantificación o concentración, para posteriores estudios. Clasificación: Las técnicas cromatográficas se han clasificado generalmente de acuerdo con las características físicas de las fases móvil y estacionaria. Según estas características se denominan las diferentes técnicas, de manera que en la definición se incluye la naturaleza de ambas fases. La naturaleza de la fase móvil puede ser: Líquida, Gaseosa la naturaleza de la fase estacionaria puede ser: Sólida, Líquida También se pueden clasificar las técnicas por el mecanismo físico que lleva a la separación de los solutos entre las dos fases. Estos mecanismos son: Adsorción, Partición, Intercambio iónico, Exclusión molecular, afinidad. La cromatografía de gases siempre se lleva a cabo en columnas, mientras que la cormatografía líquida se puede realizar sobre soportes planos (capa fina, papel) o sobre columnas. Formas de cromatografía: La ejecución de la técnica se puede llevar a cabo mediante el empleo de distintas formas de soportes inertes sobre los que actuarán las fases de separación, dando lugar a: Cromatografía en papel, capa fina o en columna. Cromatografía en papel: El soporte es plano, y consiste en una hoja de papel de celulosa de elevada pureza. La hoja de papel se encuentra recubierta de una capa de agua asociada a las fibras de celulosa, que es la que constituye la fase estacionaria; vemos, por tanto, que la fase estacionaria de esta cromatografía es líquida. La fase móvil, en la que irá disuelta la muestra, es líquida también, y está formada por solventes cuya naturaleza (polaridad) se elige en función de los componentes que se pretenden separar. Esta es, por tanto, una cromatografía líquido Ilíquido. Cromatografía en capa fina: El soporte es plano, y consiste en una capa muy fina de partículas situadas sobre una placa que suele ser de vidrio. Las placas se fabrican depositando una suspensión uniforme de partículas sobre la placa de vidrio, que posteriormente se seca y se activa por acción del calor. La fase estacionaria está constituida por partículas sólidas adheridas al vidrio generalmente de gel de sílice es, por tanto, sólida. Capítulo V Introducción a las Separaciones Cromatográficas 19

20 La fase móvil es líquida, y está formada por solventes de polaridad que va en función de la de la fase sólida estacionaria. Esta es, por tanto, una cromatografía líquido I sólido. La corrida cromatográfica se realiza dentro de una cubeta que contiene el solvente y el vidrio. Cromatografía en columna: Como se puede observar en el esquema anterior, los métodos en columna se emplean para varios tipos de cromatografía. Se emplea tanto para cromatografía líquida como para cromatografía gaseosa, y tanto con fases estacionarlas liquidas como solidas. Dependiendo de la naturaleza de las fases móvil y estacionaria, los mecanismos en virtud de los cuales se producen la separación son de dos tipos: adsorción, cuando la fase estacionaria es sólida, y partición, cuando la fase estacionaria es líquida. Las columnas con las que se trabaja en estas cromatografías están formadas por un tubo de longitud y ancho variables que lleva empaquetado en su interior un soporte sólido. Este soporte sólido puede ser la propia fase estacionaria, o bien ir asociado a un líquido que constituye la fase estacionaria. La fase móvil es un solvente que se hace pasar a través de la columna en la cromatografía líquida, o un gas en la cromatografía gaseosa. La muestra se introduce en la columna junto con la fase móvil. Las fases móvil y estacionaria se encuentran en equilibrio, de manera que la separación de los componentes de la muestra se lleva a cabo por su distribución entre las dos fases. Después de la separación en la columna, los componentes de la muestra son eluídos fuera de ésta, de forma que se obtienen distintas fracciones de fase móvil que contienen concentraciones aumentadas de los distintos componentes. Se efectúan lecturas sobre el eluído que se va obteniendo, de manera que se tiene un registro en el cual los diferentes componentes se detectan separados entre sí con distinto ancho y altura dependientes de su concentración y de la eficacia de la separación. En la actualidad, las técnicas de cromatografía en columna más empleadas son: a) Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC): Emplea instrumentos relativamente complicados, y mediante la impulsión controlada del solvente con la muestra o por medio de una bomba, consigue separaciones en tiempos cortos, del orden de minutos, que con la cromatografía líquida en columna tradicional eran del orden de horas o días. El desarrollo de soportes nuevos para las fases sólidas la han hecho cada vez de mayor aplicación b) Cromatografía de gases (CG): La fase móvil es un gas portador proveniente de un tanque a presión. En el gas se inyecta la muestra y la mezcla pasa por la columna, todos los compartimentos del cromatografo gaseoso se encuentran a alta temperatura para mantener siempre volátil la muestra que se encuentra incluida un horno para columna cuya función es mantener volatilizada la muestra. Fundamentos de la separación cromatográfica: En la mayoría de las técnicas actualmente empleadas, las sustancias son eluidas, es decir, se arrastran hasta que salen del sistema apareciendo en distintos tiempos o volúmenes del eluyente en comparación con tiempos o volúmenes de referencia. - Cromatograma: Es la representación gráfica de una corrida cromatográfica. Se obtiene graficando tiempo en abscisas y señal del detector en ordenadas. Los principales parámetros que se obtienen de un cromatograma son los siguientes: Capítulo V Introducción a las Separaciones Cromatográficas 20

21 tiempo cero (to) es el tiempo que demora en recorrer la columna hasta llegar al detector sólo la fase móvil. tiempo de retención de cada compuesto (tr) es el tiempo que demora cada compuesto en llegar al detector. Es el que nos permite identificar a cada compuesto. área del pico cromatográfico nos representa la concentración del compuesto. - Parámetros que se deben conocer para manejar estas separaciones: Velocidad de migración de las especies: La efectividad de una columna cromatográfica para separar dos analitos depende, en parte, de las velocidades relativas con las que eluyen las dos especies. Esas velocidades están determinadas por la magnitud de las constantes de los equilibrios de distribución de las especies entre las fases estacionaria y móvil. f. Constante de distribución (K): Los equilibrios de distribución implicados en cromatografía se describen por ecuaciones que suponen la transferencia de un analito entre las fases estacionaria y móvil. Así, para la especie analito A, se puede escribir A móvil A estacionaria La constante K para este equilibrio se denomina constante de distribución, razón de distribución o coeficiente de distribución, y se expresa como: K= C s / C M C s : es la concentración molar del analito en la fase estacionaria C M : es la concentración molar en la fase móvil Idealmente, el coeficiente de distribución es constante en un amplio intervalo de concentraciones; de este modo, C s es directamente proporcional a C M. La cromatografía en la que es aplicable la ecuación anterior, se denomina cromatografía lineal. g. Tiempo de retención (t R ): es el tiempo que transcurre desde de la inyección de la muestra hasta que el pico del analito alcance el detector. En la figura 2 se denomina tiempo muerto (t M ), al tiempo que emplea la fase móvil para llegar al detector. La velocidad de migración de la especie no retenida coincide con la velocidad promedio del movimiento de las moléculas de la fase móvil. La velocidad lineal media de la migración del analito es: donde L es la longitud del relleno de la columna. De manera semejante, la velocidad lineal media del movimiento u de las moléculas de la fase móvil es: u = L / t M Fig 2: Cromatograma característico de una mezcla de dos componentes. El pico pequeño de la izquierda representa una especie que no se retiene en la columna y alcanza el detector inmediatamente después de la elución. h. La velocidad de migración del soluto; factor de capacidad (k ): Se utiliza para describir las velocidades de migración de los analitos en las columnas. Para una especie A, el factor de capacidad k A se expresa como: k A = K A V S o k = t r t M V M t M donde t R y t M se pueden obtener a partir de un cromatograma. Capítulo V Introducción a las Separaciones Cromatográficas 21