PRACTICA CROMATOGRAFIA EN GEL Y CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS J.A. REIG. 1 de 20 2 de 10 1 moneda de 1 10 monedas monedas monedas de 0.

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Elisa Domínguez Salinas
hace 5 años
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1 PRACTICA CROMATOGRAFIA EN GEL Y CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS J.A. REIG Para saber lo que tengo debo separar las partes y cuantificar 1 de 20 2 de 10 1 moneda de 1 10 monedas monedas monedas de monedas de 0.01

2 CROMATOGRAFIA Y ELECTROFORESIS: Técnicas de separación y resolución de una mezcla de moléculas para aislar un componente o llevar a cabo un análisis. PRACTICA DE BIOQUIMICA : CROMATOGRAFIA DE FILTRACION EN GEL Y DETERMINACION DE PROTEINA EN PLASMA Perfil cromatografico de un veneno Fracción IV

3 CROMATOGRAFIA Diferente velocidad de desplazamiento de moléculas en una mezcla al ser arrastradas por una fase movil a través de un soporte sólido o estacionario arrastre por presión, capilaridad etc. Punto de aplicación

4 Fase estacionaria Fase movil eluyente

5 CROMATOGRAFIA EN PAPEL distancia migrada por molecula Rf= distancia migrada por frente

6 CROMATOGRAFIA DE CAPA FINA (SILICAGEL (SiO 2 2) ALUMINA (Al2O3)

8 CROMATOGRAFIA EN COLUMNA PRACTICA DE LABORATORIO H 2 O BioGel P4

9 VASO PLASTICO CON ELUYENTE (AGUA DESTILADA) COLUMNA CON GEL EN SUSPENSION PLACA POROSA CANULA GOMA GRADILLA CON TUBOS MARCADOS SIN NUMERAR PINZA DE ROSCA PIPETA PASTEUR TUBO EPPENDORF MUESTRA A SEPARAR

10 CROMATOGRAFIA SEGÚN EL SOPORTE INTERCAMBIO IONICO Separa por carga Intercambio aniónico Intercambio catiónico AFINIDAD Separa por afinidad en la unión con un dominio FILTRACION EN GEL Separa por tamaño

11 CROMATOGRAFIA DE FILTRACION EN GEL O DE EXCLUSION MOLECULAR LAS MOLECULAS SE SEPARAN EN FUNCION DEL TAMAÑO LAS GRANDES FLUYEN MAS RAPIDAMENTE, LAS PEQUEÑAS SE QUEDAN RETENIDAS MAS TIEMPO EN EL GEL Y SALEN MAS TARDE DE LA COLUMNA, DISTINTA VELOCIDAD DE MIGRACION Azul dextrano+vit B12 3ml AZUL DEXTRANO Cuantificaremos X colorimetria PM= VOLUMEN DE EXCLUSIÓN (V0) 6x3ml=18ml VIT. B12 PM=1355

13 Aplicar la muestra MUESTRA azul 1.quitar tapa 2Vaciar 2.Vaciar con Pipeta pasteur Tubo eppendorf 3. Aplicar muestra y... quitar pinza!!

14 eluyente Dejar resbalar por las paredes de la columna, sin bombardear el gel! 3mL La muestra debe penetrar en el gel sin que se seque el gel!! añadiremos un poco (2 dedos) de eluyente, para evitar distorsiones y conectamos la cánula al erlenmeyer en la leja superior con la fase movil.

Ley de Lambert-Beer Relación exponencial entre la transmisión de

VIT. B12 V0 Ve Absorbancia ba a 1 A=log Io/I A=1 lg Io/I =1

Si la absorbancia es 2 Io/I=100 se absorbe un 99% Cuanto mayor

15 Ley de Lambert-Beer Relación exponencial entre la transmisión de luz a través de una sustancia y su concentración AZUL DEXTRANO VIT. B12 V0 Ve Absorbancia ba a 1 A=log Io/I A=1 lg Io/I =1 Io/I=10 0 inciden cde 100ysae salen 10 Se absorbe un 90% de luz. Si la absorbancia es 2 Io/I=100 se absorbe un 99% Cuanto mayor absorbancia mayor concentración MAS LUZ SE ABSORBE,MENOS SALE log Io/I

16 Gel P4 RANGO EXCLUSION Vo Ve D=1,7cm r=0,85cm VitB12 AD AD= excluido Vit B12=1355 parcialmente incluida Vo volumen exterior de la columna recorrido por moléculas no incluídas (marcador= azul dextrano) Ve volumen al que sale la vit. B12 Vt= πr 2 xh Vt (cc = ml) Se puede normalizar para cada columna el comportamiento cromatografico en función de los paramentros de cada columna. Ve-Vo Kd= Vt-Vo

17 2ª parte de la práctica DETERMINACION DE CONCENTRACION PROTEICA MEDIANTE REACCION CON BIURET REACTIVO DE BIURET: Cu(SO4) y NaOH PROHIBIDAS LAS SIESTAS

18 DETERMINACION DE LA CANTIDAD DE PROTEINA EN UNA MUESTRA DE SUERO M REACTIVO BIURET (azul) Abs SOLUCION ESTÁNDAR Muestra ALBUMINA 10mg/ml suero Reactivo 1 M Abs Y=mX+b Y=mX x mg proteina

19 abs ,5mg/0.1ml mg Proteina L=0.1mL ajustar una recta

20 PIPETAS DE VIDRIO Y PIPETEADORES

22 Tubo/Abs ,03 3-0,01 4-0,06 5-0,7 6-0,23 7-0, etc Cromatografia en gel que separa por. P4/ INDIVIDUAL!! NOMBRES Y APELLIDOS (CON MAYUSCULAS) Φ=1,7 cm Abs 0.50 A Vo Ve Tubo/abs 1(0mg)/0 2(1mg)/0,05 6(10mg/0,28 Abs A=0.12 X=7,7mg/0.1ml mg PROTEÍNA Tubo nº/ml x10 77mg/mL 3 ml Manual=77 Ordenador=72,7 =3ml/xmin3 i LOS CUESTIONARIOS SE ENTREGAN AL FINALIZAR!

25 OTRAS CROMATOGRAFIAS CROMATOGRAFIA DE GASES

26 Identificacion en base a standars

27 CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA PRESION (HPLC) Adsorventes de distinta hidrofobicidad son empaquetados en columnas? Si sac F2- F1+ sac

28 ELECTROFORESIS: MIGRACION DIFERENCIAL DE MOLECULAS EN EL SENO DE UN CAMPO ELECTRICO SOBRE UN SOPORTE DETERMINADO. PAPEL AGAROSA POLIACRILAMIDA MOVILIDAD DEPENDE DE CARGA Y TAMAÑO - pi +

29 ELECTROFORESIS EN AGAROSA ACIDOS NUCLEICOS

30 ELECTROFORESIS DE SDS-POLIACRILAMIDA PROTEINAS REVELADO CON COLORANTES: AZUL DE COOMASSIE

31 MUCHO CUIDADO EN EL LABORATORIO...! No olvideis la bata de laboratorio No olvideis los guiones de prácticas No olvideis traer firmado la hoja de conocimiento de normativa No olvideis una calculadora, un lapiz y una goma...

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