ELECTROFORESIS. Objetivo de la clase. fundamentos procedimientos *algunas aplicaciones. Conocer los métodos electroforéticos

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Miguel Ángel Rico Lagos
hace 5 años
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1 ELECTROFORESIS Objetivo de la clase Conocer los métodos electroforéticos *fundamentos *procedimientos *algunas aplicaciones

2 Definición de electroforesis Proceso de separación que se basa en la diferente velocidad de migración que poseen las moléculas cargadas (iones) cuando son sometidas a la acción de un campo eléctrico. v ión = m ión x E v: velocidad de migración iónica m: movilidad iónica (depende de la carga, peso molecular y forma del ión) * E: campo eléctrico aplicado, definido por V/L (voltaje aplicado dividido la distancia en la cual se aplica el voltaje) *ph y la fuerza iónica del medio líquido en el que se produce la separación

3 Aminoácidos y proteínas Cargas en función del ph del medio Punto isoeléctrico:pi aa Proteínas pi

4 Ácidos nucleicos Cargas negativas de los grupos fosfato ADN ARN

5 SOPORTES Semisólidos Gel de agarosa (AN) Gel de poliacrilamida PAGE (proteínas) moldes para armar los geles

Molde abierto (metacrilato) Vidrio trasero Gel Vidrio

6 MOLDES PARA ARMAR LOS GELES Vertical (proteínas) Peine (calles para las muestras) Horizontal (ácidos nucleicos) Molde abierto (metacrilato) Vidrio trasero Gel Vidrio frontal Cinta adhesiva (para cerrar el molde) Peine (calles para las muestras)

7 Equipos para realizar electroforesis vertical Soportes para armar geles Cuba electroforética Vidrios Peines Electrodo

8 Electroforesis vertical Vertical Electroforesis horizontal Horizontal Cátodo Ánodo muestra Buffer Cátodo gel Ánodo Gel Buffer Buffer

9 Existen diferentes formas de realizar una electroforesis: I- Electroforesis de zona (es la más difundida) separa por la relación carga/masa II- Electroforesis de estado estacionario (isoelectroenfoque) separa proteínas en función de su punto isoeléctrico

10 I- Electroforesis de zona PROTEINAS 1- Armado del gel vertical de poliacrilamida 2- Armado del equipo de electroforesis con el buffer de corrida 3- Siembra de las muestras a analizar 4- Aplicación del campo eléctrico 5- Finalizar la corrida cuando el frente de corrida llegue al extremo inferior del gel

11 I- Electroforesis de zona PROTEINAS Siembra de muestras Concentración de la muestra Separación de proteínas Cátodo Gel concentrador Gel de resolución Ánodo

Brillante de Coomasie; tinción con AgNO 3 ) (reacciones

12 I- Electroforesis de zona PROTEINAS 6- Retirar el gel cuidadosamente 7- Etapa de revelado (tinción con Azul Brillante de Coomasie; tinción con AgNO 3 ) (reacciones enzimáticas de color, inmunodetecciones) Azul Brillante de Coomasie tinción con AgNO 3

13 I- Electroforesis de zona PROTEINAS Electroforesis nativa Electroforesis desnaturalizante SDS anula el efecto carga A+B Carga, peso molecular y forma Peso molecular

II- Electroforesis de estado estacionario (isoelectroenfoque) PROTEINAS Separa en función del punto isoeléctrico de cada proteína cátodo Gradiente de ph

14 II- Electroforesis de estado estacionario (isoelectroenfoque) PROTEINAS Separa en función del punto isoeléctrico de cada proteína cátodo Gradiente de ph inmovilizado en un gel PAGE + anfolitos ánodo cátodo - 0 ánodo cátodo 0 0 ánodo Proteína con pi entre 6 y 7 Proteína con pi entre 5 y 6

15 Aplicaciones Caso 1- Determinar el peso molecular de una proteína Se usa una electroforesis desnaturalizante. 1- Marcadores de peso molecular 2- Proteína desconocida Migración relativa

Aplicaciones Caso 3- Diagnóstico de microorganismos fitopatógenos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Podredumbre morena hongo del género Monilinia M. frutigens M.

fruticola 1: marcadores de peso molecular 2: fragmento de ADN que identifica a frutigens 3: fragmento de ADN que identifica a laxa 4: fragmento de ADN

16 Aplicaciones Caso 3- Diagnóstico de microorganismos fitopatógenos Podredumbre morena hongo del género Monilinia M. frutigens M. laxa M. fruticola 1: marcadores de peso molecular 2: fragmento de ADN que identifica a frutigens 3: fragmento de ADN que identifica a laxa 4: fragmento de ADN que identifica a fruticola Muestras de ADN obtenidas de duraznos uruguayos enfermos 5-10 "Monilinia fructicola", única especie presente ocasionando la podredumbre morena del duraznero (Prunus persica) en Uruguay. Silvera Elisa y col. Fitopatología, ISSN , Vol. 39, N 3, 2004, págs

17 Bibliografía -Mikkelsen y Cortón. Química Bioanalítica. Métodos y teoría analítica para el laboratorio de biología molecular, farmacia y bioquímica. Primera edición Editorial EUDEBA. -Voet, Voet y Pratt. Fundamentos de Bioquímica. La vida a nivel molecular. Segunda edición Editorial Médica Panamericana SA. -Methods in Plant Biology. A laboratory course manual. Maliga, Klessing, Cashmore, Gruissem and Varner Cold spring harbor laboratory press. -Harris. Análisis Químico cuantitativo. Segunda edición en castellano Editorial Reverté SA. -VIDEOS YouTube -Electroforesis de proteínas (tutorial). Divulgación científica. IQOG- CSIC. Publicado en febrero de Acceso en abril de min. -Electroforesis en gel de agarosa. Universidad Politécnica de Valencia. Acceso en abril min.

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