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1 TRABAJO PRACTICO Nº 3. PROTEINAS Y ENZIMAS. Objetivo - Utilizar reacciones generales y técnicas de extracción y separación adecuadas para el análisis de proteínas y enzimas, así como de aminogrupos provenientes de ellas. Introducción Las proteínas son polipéptidos. La palabra péptido comprende una amplia serie de compuestos que varían desde pesos moleculares bajos a muy elevados y muestran diferencias marcadas en cuanto a sus propiedades físicas, químicas y farmacológicas. Los miembros más inferiores derivan de sólo dos moléculas de aminoácidos, pero los superiores tienen muchas unidades de aminoácidos y forman PEPTIDOS, PROTEINAS SIMPLES (albúminas, globulinas, protaminas, glutalinas, entre otras) o PROTEINAS COMPLEJAS CONJUGADAS, en las cuales forman parte de la molécula otros grupos, por ejemplo hidratos de carbono en las mucoproteínas, fósforo en la caseína, lipoproteínas, etc. Todos estos compuestos más o menos complejos tienen dos o más moléculas de aminoácidos unidas por un enlace peptídico que resulta de la eliminación de agua, procediendo un OH - de un a.a. y un H de otro. Por lo tanto un dipéptido se formará así: R-CH(NH 2 )COOH + R*-CH(NH 2 )COOH R-CH(NH 2 )CO-NH-(COOH)CH-R* + H 2 O Los péptidos suelen definirse como sustancias de tipo proteínico que poseen PM por debajo de En las proteínas típicas el PM es mayor (30000 a en las prolaminas y glutelinas por ejemplo), y alcanzan valores muy elevados en las complejas, como las de la lana de oveja. ENZIMAS: en general son proteínas aunque se han encontrado algunas de distinta estructura. Poseen capacidad catalítica específica (aceleran una reacción química sin que éstas sufran cambios, al igual que un catalizador químico). Presentan lo que se conoce como especificidad por el sustrato (distinción entre una forma cis y una trans) y especificidad por la catálisis (sólo reduce, desamina). Ejemplos: carbohidrasas: ej. amilasa, dextrinasa. estearasas: ej. lipasa. proteasas: ej. tripsina, papaína. 63

2 ACTIVIDADES PRACTICAS 1) Efectuar la reacción de la Ninhidrina sobre el infuso de la droga vegetal en estudio obtenido en el trabajo práctico de extracción. Reacción de la Ninhidrina: revela la presencia de aminogrupos primarios o secundarios. Se hace sobre papel de filtro. Se coloca una gota de la muestra o solución a ensayar sobre papel y se deja secar. Se agrega una cantidad similar de solución etanólica de ninhidrina al 0,2 % y paralelamente se hace un ensayo en blanco (reactivo solo) y uno del testigo (triptofano al 50 % en etanol) con el reactivo. Se calienta el papel en estufa ( ºC) hasta aparición de ligero color en el blanco. Se compara la intensidad de la mancha azul-violácea con la coloración de la solución testigo. 2) Analizar las proteínas presentes en el infuso de la droga vegetal en estudio mediante electroforesis vertical en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE). ELECTROFORESIS Las proteínas son polielectrolitos anfóteros que contienen, al menos un grupo ácido (COOH) y otro básico (α-amino). La carga neta de una proteína determinada depende del ph del medio en que se disuelve. Si a una solución heterogénea proteica, tamponada, se le aplica un campo eléctrico, se producirá una migración diferencial de las proteínas en solución según su densidad de carga. Para ello se impregna una tira de papel de filtro con una solución buffer conductora sobre la que se depositan unos microlitros de la muestra en forma de mancha o banda angosta. Se aplica una diferencia de potencial entre los extremos de la tira, que están en contacto con los compartimentos de electrodos. La mancha o banda se extiende y se despliega cuando cada componente migra hacia uno u otro electrodo a una velocidad determinada principalmente por su movilidad electroforética. Después de dejar pasar el tiempo suficiente para una buena separación, la tira se quita y se seca. La posición de las bandas se detecta mediante reacciones de color o conteo radiactivo. Otra forma es realizar una electroforesis en geles de poliacrilamida en donde mediante el tratamiento con dodecil sulfato de sodio (SDS) todas las proteínas presentes en una muestra adquieren la misma densidad de carga, por lo que se logra entonces su separación de acuerdo a su masa molecular. 2.1) Obtención de la muestra para realizar la electroforesis Pesar 1 mg de infuso, agregar un volumen de buffer de siembra (30 50 μl) y mantener la mezcla durante 3 minutos en baño de agua a 90 C. La mezcla puede conservarse en freezer. 2.2) Electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) Se utilizará un equipo Bio Rad Mini Protean II y se trabajará con un gel al 10 % preparado como se indica más abajo Preparación de los geles. Reactivos: 1- Buffer catódico ( 0,1 M; Tricina 0,1 M; SDS 0,1 %): 6,055 g 64

3 Tricina SDS Agua destilada, c.s.p. : [Tris(hidroximetil)aminometano] Tricina: N-[Tris(hidroximetil)metil]glicina. 8,960 g 0,500 g 500 ml 2- Buffer anódico: (Tris HCl 0,2 M; ph 8,9): 21,180 g Tris HCl 3,840 g Agua destilada, c.s.p ml Tris HCl: [Tris(hidroximetil)aminometano].HCl. 3- Gel buffer: Tris HCl SDS Agua destilada, c.s.p. 25,170 g 14,550 g 0,300 g 100 ml 4- Buffer de siembra ( sample buffer, debe conservarse a temperatura ambiente): Tris HCl, ph 6,8 1,0 ml 2-mercaptoetanol 0,4 ml Glicerol 0,8 ml SDS (10 % w/v) 1,6 ml Azul de bromofenol al 0,05 % (w/v) 0,2 ml 5- Tris HCl, ph 6,8: 6,000 g Agua 60 ml Se ajusta el ph a 6,8 con ácido clorhídrico concentrado y se completa hasta un volumen final de 100 ml con agua. Debe conservarse en heladera, a temperaturas 4 C. 6- SDS al 10 % (w/v): obtenido por disolución de 10 g de dodecil sulfato de sodio en agua y ajuste del volumen a 100 ml. 7- Acrilamida/Bis Acrilamida (30 % T; 2,67 % C)= Monómero: Acrilamida 29,200 g N,N -bis-metilén- -acrilamida 0,800 g Agua destilada, c.s.p. 100 ml La suspensión filtrada se conserva a 4 C, protegida de la luz, por no más de 30 días. 8- APS al 10 %: solución de persulfato de amonio al 10 % w/v en agua desionizada. 9- Colorante para proteínas: solución al 0,1 % (w/v) preparada por disolución del reactivo Coomasie Blue R-250 en una mezcla constituida por metanol ácido acético agua (4:1:6). 10- Decolorante: mezcla formada por metanol ácido acético agua, (3:1,2:5,8). 65

4 Procedimiento de preparación de los geles. Los geles se arman en el soporte de armado ( casting stand ) según las instrucciones del manual de Bio Rad. Se utilizan espaciadores de 0,75 mm y peines de 10 calles. Se marca con un marcador para vidrio 1 cm por debajo del borde del peine (1 cm del gel concentrador, stacking gel ). A continuación se presenta una tabla ilustrativa de los componentes de los geles y las cantidades de cada uno recomendadas en cada caso. El orden en que están ubicados los reactivos corresponde al que debe seguirse durante el agregado de los mismos en el armado de los geles. Reactivos SDS-PAGE (Gel separador) Gel concentrador 10 % para 1 gel para 2 geles Monómero 2,0 ml 0,66 ml H 2 O destilada 1,2 ml 3,10 ml Gel Buffer 2,0 ml 1,24 ml Glicerol 0,65 ml - TEMED 5 μl 6 μl APS 10 % 50 μl 60 μl Siembra de la muestra. La muestra preparada como se indicó en 2.2.1, se siembra en la calle correspondiente del gel, con un volumen máximo de 25 μl Condiciones de corrida. Desarrollo en el gel concentrador: a 40 V. Desarrollo en el gel separador: se aumenta gradualmente desde 40 V hasta llegar a 60 V durante 15 min, luego se eleva a 80 V por otros 15 min y finalmente a 100 V como máximo, dejado en ese valor durante toda el resto de la corrida. Al finalizar la electroforesis y antes de abrir el sistema se baja el voltaje a 15 V Coloración de los geles para la localización de las proteínas. Una vez finalizada la corrida, se separa el gel y se transfiere a una cuba en donde se le agrega el colorante Coomasie blue R250 preparado como se indicó anteriormente, y se lo deja en contacto durante 1 h a temperatura ambiente. Luego se procede al desteñido dejando el gel en contacto con la solución decolorante con cambios sucesivos de la misma hasta que solo se visualizan las bandas correspondientes a las proteínas y/o péptidos de color azul violáceo y el resto del gel se observe transparente. La coloración es estable si se conservan los geles en solución decolorante Determinación de las masas moleculares de las proteínas. Graficar Log de las masas moleculares de las proteínas del estándar (márket de masas moleculares) versus las respectivas distancias recorridas. A continuación se miden las distancias recorridas por la/s proteínas de la muestra y se extrapolan en la recta obtenida del márket. Se calcula entonces la masa molecular aparente de cada sustancia de la muestra. BIBLIOGRAFIA 66

5 - Treasse- Evans, Farmacognosia. 13º Ed Interamericana Mc Graw Hill. - Dominguez, J. A., Métodos de Investigación Fitoquímica México, Limusa. - Santomé, J. A., Microtécnicas para la Purificación y Secuenciación de Péptidos y Proteínas UBA. - Flores, M.L., Estudio de las paredes celulares del alga roja Iridaea undulosa Bory, Tesis doctoral, FCN, UNPSJB,