Trabajo Práctico 5: Electroforesis de proteínas Electroforesis de proteínas en Acetato de celulosa

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1 Trabajo Práctico 5: Electroforesis de proteínas Electroforesis de proteínas en Acetato de celulosa OBJETIVO: -Realizar electroforesis de las proteínas presentes en suero utilizando acetato de celulosa como soporte. FUNDAMENTO: La electroforesis es una técnica que permite separar sustancias cargadas por influencia de un campo eléctrico externo. La separación electroforética se basa en la diferente velocidad de migración que experimentan en un campo eléctrico las distintas partículas largadas eléctricamente. La velocidad de migración depende principalmente de la densidad de carga y de la intensidad del campo eléctrico aplicado. Debido a la naturaleza anfolítica, la carga eléctrica de las proteínas se modifica con el ph del medio, definiéndose entonces como punto isoeléctrico (pi), al ph en el cual la molécula no tiene carga eléctrica neta y entonces no migrará en un campo eléctrico. Si el ph se encuentra por debajo del pi, predominan las cargas positivas y a la inversa a un ph superior al pi. En la práctica, para separar por electroforesis a las proteínas séricas, se elige un ph por encima del pi de las mismas, alrededor de 8,5 usándose para esto un buffer. Las tiras de cellogel se guardan en metanol al 40%, por esto es necesario lavarlas primero con abundante agua y luego somergirlas en la cuba con el buffer de electroforesis Veronal sódico (dietilbarbiturato de sodio 40 mm ph 8,5 ) por 10 minutos. Escurrir el exceso de buffer y colocar la tira sobre el soporte de la cuba, con la superficie opaca hacia arriba, debiendo quedar bien fija y plana. Sembrar el suero con un aplicador en la zona del cátodo y aplicar corriente de 2 ma por tira). Una vez finalizada la corrida, que dura unos 45 minutos, se sumege la tira 5 minutos en el colorante, que puede se Amidoschwartz (0,5% en metanol, agua, ácido acético 4,5 : 4,5 : 1) o Ponceau S (rojo Ponceau 0,5% en ácido tricloroacético, agua 5:95) Las tiras se decoloran en solución decolorante (metanol, agua, ácido acético 47,5 : 47,5 : 5), de tal manera que finalmente sólo retienen el color las bandas de proteínas. 1

2 Electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) OBJETVOS - Utilizar el método electroforético SDS-PAGE para separar los componentes de una mezcla, según su tamaño. -Calcular gráficamente la masa molecular aparente de proteínas por comparación con proteínas patrones, en un gráfico de distancia vs. Log Mw aparente. FUNDAMENTOS La electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) es una técnica muy apreciada en la separación de proteínas y ácidos nucleicos, permitiendo separaciones por densidad de carga o por tamaño molecular Los geles sirven de tamices moleculares que potencian la separación. Las moléculas más pequeñas que los poros se desplazan fácilmente a través del gel. Las moléculas mucho mayores quedan casi inmóviles y las moléculas de tamaños intermedios se desplazan a través del gel con diversos grados de dificultad. Los geles de poliacrilamida son los soportes de elección para la electroforesis porque son químicamente inertes y se forman con facilidad mediante polimerización de la acrilamida. Además variando la concentración de acrilamida y metilenbisacrilamida se pueden conseguir tamaño de poro controlados. El tipo de gel que se realizará en el práctico es llamado discontinuo o tipo Laemli, que se basa en utilizar dos tipos de geles, el primero llamado de siembra, estaqueo o staking, preparado en buffer tris clorhidrico ph 6,8, y el segundo llamado de resolución, corrida o running, preparado con buffer tris ph 8,8. Los buffers de ánodo y cátodo son de ph 8,3, debiendo contener el segundo glicina o tricina. El primer gel, staking, es un gel de baja concentracion (4%), es decir de poro grande, en donde a ph 6,8 los iones Cl - se ubican por delante de las proteínas, formándose un borde de arrastre por detrás de las proteínas, formado por glicina, que resulta entonces en una zona de baja conductividad permitiendo que la muestra se concentre y llegue al gel de running, en cuyo ph se invierte la ubicación de corrida de la glicina y el Cl - y se producirá la separación de las proteínas en este gel. El dodecil sulfato de sodio (SDS) conocido también como lauril sulfato, es un detergente aniónico capaz de romper las interacciones no covalentes, el cual se agrega en la preparación de la muestra con un agente reductor, Mercaptoetanol para reducir los puentes disulfuro de tal manera de desnaturalizar la proteína. Los polipéptidos desplegados se unen al SDS 2

3 cargándose negativamente, siendo en general, la cantidad de SDS unido proporcional al peso molecular del polipéptido e independiente de su secuencia. La unión es aproximadamente de una molécula de SDS cada dos aminoácidos, cubriendo en exceso toda carga neta (al ph en que se está trabajando), siendo entonces la relación carga/masa similar para todas las proteínas, pudiéndose separar estas por su masa molecular (y no por su densidad de carga) por acción de los poros del gel. Así, los complejos SDS- proteína formados se someten a electroforesis sobre gel de poliacrilamida. La dirección de la corrida es vertical descendente. Las bandas se visualizan cuando se tiñen con colorante Azul de Coomasie. Las proteínas pequeñas se desplazan rápidamente y las proteínas grandes permanecen arriba cerca del punto de aplicación. El desplazamiento es proporcional al logaritmo de su masa pudiendo realizarse una curva de calibración de pesos moleculares. Utilizando proteínas de peso molecular conocido, y midiendo las distancias de corrida, podemos graficar log pm /distancia recorrida, lo que da una recta. Si medimos la distancia recorrida por una muestra incógnita podremos determinar el pm (llamado aparente) de la proteína. Para esto las proteínas deberán poder verse, para lo cual primero serán coloreadas, siendo el colorante más usado el Coomassie Brilliant Blue R250, con posterior decoloración en un sistema de solventes. PARTE EXPERIMENTAL 1- Determinación del PM de una proteína homogénea Se siembra una proteína homogénea. Luego del revelado se compara la distancia recorrida por la misma respecto del colorante marcador del frente, con la distancia recorrida por las proteínas patrones de PM que fueron sembradas en carriles adyacentes. Se construye un gráfico de log PM en función de la distancia recorrida en cm. y por interpolación se obtiene el PM desconocido. Proteína del Patrón Masa molecular Fosforilasa b 97,4 KDa Seroalbumina bovina 66,2 KDa Ovoalbúmina 45,0 KDa Anhidrasa carbónica 31,0 KDa Inhibidor tripsina 21,5 Kda Lisozima 14 Kda 3

4 2- Resolver y graficar Se determinó el PM de una proteína X analizándola simultáneamente con proteínas patrones, mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. La corrida electroforética se llevo a cabo a ph 8,0 y en presencia de SDS. Los resultados fueron los siguientes: PROTEINA DISTANCIA RECORRIDA (cm) PM (Da) Seroalbúmina 3, Quimiotripsina 4, Citocromo C 5, Proteína X 4,1? a- Haga un diagrama del gel indicando la posición de las distintas proteínas. Indique en el diagrama el punto de siembra de la muestra y la posición del ánodo y cátodo. b- Calcule el PM de la proteína X. c- Si la electroforesis se realiza en poliacrilamida, a ph 8,0, sin SDS, podría calcular el PM de la proteína X de la misma manera que en b? Por qué? Equipo Electroforético: La cubeta tiene en sus extremos los reservorios para el tampón de electroforesis. En el centro se aloja el soporte (gel), con la muestra aplicada en su parte central. Por las tiras de papel laterales fluye el tampón, por capilaridad, manteniéndose asi humedecidos el soporte. El refrigerante disipa el calor generado por el paso de la corriente eléctrica. La fuente de alimentación proporciona la diferencia de potencial entre los electrodos. APLICACIONES φ DETERMINACIÓN DE TAMAÑOS MOLECULARES φ ESTUDIOS DE HETEROGENEIDAD MOLECULAR (VARIANTES 4

5 GENÉTICAS) φ INTERACCIONES (AGREGACIÓN, DISOCIACIÓN, LIGANDORECEPTOR) φ IDENTIFI φ MODIFICACIONES POSTTRADUCCIONALES (GLICOSILACIÓN, FOSFORILACIÓN) φ ISOENZIMAS φ CONTROL DE CALIDAD φ ADULTERACINES φ DETERMINACIÓN DE TAMAÑOS AS 5