BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR. LABORATORIO No 9: ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA (SDS-PAGE)

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1 BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR LABORATORIO No 9: ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA (SDS-PAGE) 1. INTRODUCCIÓN Uno de los métodos que permite la purificación y separación de proteínas de un organismo es la electroforesis; con el uso de esta metodología es posible obtener información sobre el tamaño molecular y la pureza de las proteínas, así como también el número y tamaño molecular de las subunidades que lo componen (Sambrook et al, 1989). 2. OBJETIVOS - Conocer al sistema vertical de electroforesis usando el método SDS- PAGE para el análisis de proteínas - Reconocer los componentes peptídicos de una proteína en estudio. - Utilizar azul coomassie como método de tinción de proteínas - Aplicar conceptos de reducción, desnaturalización, iónico, entre otros, en el marco de un corrido electro fotométrico. 3. MARCO TEORICO Etiológicamente la palabra electroforesis significa transporte de electricidad, cualidad utilizada en la prueba en la cual una partícula cargada se hace desplazar a través de un medio aplicando un campo eléctrico. La densidad de la carga de la partícula depende de características como el ph, fuerza iónica, gradientes de voltaje, interacciones con el soporte, etc. Cuando una partícula cargada se coloca en el seno de un campo eléctrico, se moverá hacia el polo positivo o negativo, en función de la carga que posea (Bula, 1982). Utilizando como interfase geles de poliacrilamida se puede realizar un entrecruzamiento variable a voluntad entre las fibras del polímero, obteniéndose así una trama tridimensional cuyo tamaño de poro se puede controlar. De esta manera el efecto del campo eléctrico se une al efecto del tamiz molecular, por lo que las proteínas se separan en función de su tamaño. Una variante de esta metodología es la utilización de detergentes los cuales proporcionan la carga de la proteína, permitiendo que esta migre en un campo eléctrico. (Laemmli, 1970). El rango efectivo de separación de los geles depende de la concentración de poliacrilamida y de la cantidad de radicales libres entre los dos polímeros. El

2 tamaño del poro disminuye cuando la reacción bisacrilamida: acrilamida se incrementa. Conservando un radio de 1:29 respectivamente, se cree que la resolución de polipéptidos puede diferir en tamaño en menos del 3% (Ver Tabla 1) (Sambrook et al, 1989). Tabla 1. Rango efectivo de separación de geles de poliacrilamida-sds (Sambrook, 1989). Concentración de Rango linear de separación (kda) Acrilamida (%) (Sambrook et al. 1989). Como agentes desnaturalizantes está el Dodecil Sulfato de Sodio (SDS) el cual además carga negativamente el péptido a analizar. El complejo polipéptido migra a través del gel de poliacrilamida de acuerdo al tamaño del polipéptido. Usando marcadores de peso molecular conocido, es posible estimar el peso molecular de la cadena polipeptídica. La electroforesis en gel de poliacrilamida, requiere de un sistema de buffers en donde el buffer de los reservorios es de ph diferente al buffer que contiene el gel; de la habilidad de este buffer para concentrar los complejos polipeptídicos en la muestra, dependerá el incremento de la resolución de separación de las cadenas en el gel de poliacrilamida (Sambrook et al, 1989). NOTA: revisar todos los aspectos teóricos y realizar un taller sobre profundización de este tipo de electroforesis, para discutir con los alumnos y mediante artículos ejemplificar las aplicaciones de la misma. A continuación se presenta detalladamente un protocolo completo para realizar un análisis de proteínas, el cual se revisara y analizara con los estudiantes, mostrando el equipo utilizado para electroforesis vertical como modelo a seguir, pero la práctica como tal, se llevara a cabo en varias sesiones en el componente de virología.

3 4. PRE-LABORATORIO 1. Qué es la fuerza electroendosmótica? 2. Cómo influyen el ph y el E sobre el flujo electroendosmótico? 3. Cómo se puede comprobar experimentalmente la fuerza electroendosmótica de un medio soporte? 4. Qué etapas incluye un fraccionamiento electroforético? 5. Indique por lo menos 4 procedimientos diferentes para detectar compuestos proteicos después del fraccionamiento electroforético. 6. Cuál es el fundamento del análisis de las fracciones electroforéticas por densitometría? Cuáles son los componentes del densitómetro? 7. Cuál es el fundamento del fraccionamiento en PAGE? 8. Cómo se obtiene el gel de poliacrilamida, b) qué precauciones hay que tener durante la preparación de los mismos, c) qué catalizador e iniciador empleó en el trabajo práctico, d) podría emplear monómero entrecruzador e iniciadores de la reacción de polimerización alternativos a los mencionados? 5. MATERIALES Todos los reactivos deben ser de grado electroforético y el agua debe ser destilada y desionizada. - Acrilamida 30% (p/v) 50 ml - Bisacrilamida 2% (p/v) 50 ml Estos dos reactivos deben ser filtrados por membrana de 0,45 µm y almacenados en recipientes oscuros a 4 o C por no más de 40 días. NOTA: LA ACRILAMIDA ES NEUROTÓXICA. USAR CARETA AL PESAR Y GUANTES DURANTE TODA LA MANIPULACIÓN. - Persulfato de amonio 10% (p/v) Preparar en el momento del uso. -TEMED Tomar una alicuota del reactivo (caja con alicuotas en la nevera 1) y guardar a 4 0 C en oscuridad. - TRIS 1 M/ácido ortofosfórico ph ml Pesar 6.05 g para 50 ml. Antes de completar el volumen cuadrar el ph con ácido ortofosfórico (P.M.: 121.1g). Almacenar a 4 C. - TRIS 3 M/HCl ph ml Pesar 36.3 g para 100 ml. Antes de completar el volumen cuadrar el ph con HCl. Almacenar a 4 C - SDS 10% (p/v) 50 ml

4 Preparar en agua y almacenar a temperatura ambiente - Agarosa 1% (p/v) 100 ml Disolver en agua y llevar al horno microondas para su disolución Buffer separador 4x (TRIS 1.5 M + SDS 0.4%) -TRIS 3 M/HCl ph ml - SDS 10% 4.0 ml Completar con agua hasta 100 ml. Almacenar a 4 C por un mes. Buffer concentrador 4x (TRIS 0.5 M + SDS 0.4%) - TRIS 1 M/ ácido ortofosfórico ph ml - SDS 10% 2 ml Completar con H 2 O hasta 50 ml. Almacenar a 4 C por un mes. Stock de buffer muestra 6x (para sistemas discontinuos) - Buffer concentrador 4X 7 ml - Glicerol 3 ml - SDS 1 gr - Azul de bromofenol 1.2 mg Mezclar, agregar agua si es necesario para completar 10 ml. Congelar a -70 C en alicuotas. Buffer muestra 2x (Solución de trabajo). Preparar 1 ml de buffer 2X a partir del stock 6X con agua destilada. Adicione β- mercapto etanol en la cabina de extracción a una concentración final del 2 % respecto al buffer 2X. SDS buffer electroforesis 5X 10X TRIS base 25 mm 15 gr 30 gr Glicina 192 mm 72 gr 144 gr SDS 0.5 % 5 gr 10 gr Llevar a un litro con H 2 O y almacenar a 4 C. Usar en concentración final 1x. Utilizar máximo 3 veces. El volumen de la cámara de minielectroforesis - BRL es de 600 ml (Utilizar 120 ml cuando se use el stock 5X ó 60 ml cuando se use el stock 10X y llevar a 600 ml) GEL SEPARADOR La concentración total de monómeros de acrilamida T (acrilamida y bisacrilamida) determinan las características del gel. Teniendo en cuenta el peso molecular de la proteína en estudio se escogen los diferentes porcentajes para obtener el gel

5 adecuado. Acrilamid a 30% Bisacrilami da 2% Buffer Separador 4X H 2 O Persulfato de amonio µl) * T13C T12C T10C T9C T8C T8C T8C T7C T6C TEMED * µl) * Estos dos reactivos deben agregarse cuando ya se va a servir el gel. Antes de agregar el persulfato de amonio y el temed de airear la mezcla durante 5 a 15 minutos. GEL CONCENTRADOR Acrilamida 30% Bisacrilam ida 2% Buffer concentra dor 4x H 2 O Persulfato de amonio 10% * (µl ) T4.4 C TEMED * (µl ) * Estos dos reactivos deben agregarse cuando ya se va a servir el gel. Antes de agregar el persulfato de amonio y el temed de airear la mezcla durante 5 a 15 minutos. 6. PROCEDIMIENTO Los vidrios deben estar perfectamente limpios y secos. Deben lavarse con detergente (extrán) y bastante agua, finalmente lavarlos con agua destilada/desionizada. Armar el sistema utilizando separadores y peinillas del mismo grosor. Colocar los separadores (0.75 mm) entre los dos vidrios (en los extremos) y apretar el sistema con 2 ganchos, colocar éste en la mesa para hacer geles previamente nivelada, sellar con agarosa al 1%. Servir el gel separador y agregar cuidadosamente sec-butanol hidratado (200 µl) o etanol. Cuando el gel polimerice (T8C min. aprox.), retirar el sec-butanol y lavar con agua. Secar el espacio entre los dos vidrios con papel absorbente evitando tocar el gel separador. Vertir el gel concentrador y colocar la peinilla inmediatamente. Una vez haya polimerizado el gel retire la peinilla y los ganchos. Lavar con agua

6 destilada y cuidadosamente colocar el sistema en la cámara de electroforesis, la cual contiene buffer de corrida 1x. CORRIDO ELECTROFORETICO Preparación de las muestras Mezclar con rapidez y a 4 C en un tubo eppendorf volúmenes iguales de muestra y buffer muestra 2x. Sellar con parafilm y hervir por 5 min a 100 C. Sembrar las muestras (20 µl) con la jeringa de 50 µl en la concentración predeterminada y los marcadores de peso molecular 3-5 µg/µl (3-5 µl) con la jeringa de 5 µl. Al sembrar las muestras lavar muy bien la jeringa con agua entre una y otra. Correr la electroforesis a 70 voltios hasta que el frente alcance la parte superior del gel separador y luego llevarla a 120 voltios hasta que el azul de bromofenol llegue al borde inferior del gel. Tinción de Coomasie Para visualizar las bandas correspondientes a los componentes de la proteina en estudio (peptidos proteicos ) es necesario realizar una tincion o coloracion especifica de proteinas, en este caso se usara la tincion con azul de Coomasie. Preparación del colorante Coomasie brillant blue R gr Isopropanol 250 ml Acido acético 112 ml H 2 O 550 ml Filtrar 2 veces con papel Whatman 3M. Almacenar a temperatura ambiente. Sensibilidad: 0.1 a 0.5 µg/banda. Solución decolorante Ácido acético 100 ml Isopropanol 100 ml Llevar a 1 litro con H 2 O. Procedimiento -Sumergir el gel en 100 ml del colorante, o la cantidad necesaria para cubrir bien el gel -Dejar en coloración con agitación constante (agitador mecánico) durante 1 horas -Descartar el colorante y sumergir el gel durante 1 hora, en la solución decolorante para eliminar el exceso de coloración, lo cual permite una mejor identificación de las bandas proteicas. NOTA:

7 -Puede requerirse una segunda decoloración para visualizar las bandas de la proteína. -Descartar la solución decolorante, y sumergir el gel en agua hasta el momento del secado. 7. POST-LABORATORIO 1. Qué utilidad tiene el β-mercaptoetanol en la preparación de la muestra? 2. Cuál es la función de los reactivos persulfato de amonio y TEMED en la preparación del gel? 3. Cómo debe ser la estructura de la proteína para ser corrida por electroforesis? 4. Qué función tienen el Buffer muestra en una electroforesis de proteínas? 5. Para qué se utiliza un gel separador y un gel concentrador? 6. Qué características tiene la poliacrilamida? 8. BIBLIOGRAFIA -- Almonacid, C Pinilla G. Introducción al análisis Bioquímico y a sus métodos de separación. Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca. Imprenta Nacional Sambrook, J., Fritschh, and Maniatis, T. Molecular cloning a Laboratory. 2da Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press Hames, BD.& Rickwood, D. Gel electroforesis of protein, a practical approach. IRL. Perss. Oxford. Washington D.C AUTOEVALUACION NUMERO DE LA PRACTICA SI LOGRO (Objetivos cumplidos) NO FORTALEZAS DEBILIDADES SUGERENCIAS A CADA DEBILIDAD