TRABAJO PRACTICO Nº 3. PROTEINAS Y ENZIMAS.

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1 UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PATAGONIA SAN JUAN BOSCO FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES DEPARTAMENTO DE FARMACIA CATEDRA DE FARMACOGNOSIA TRABAJO PRACTICO Nº 3. PROTEINAS Y ENZIMAS. Objetivo - Utilizar reacciones generales y técnicas de extracción adecuadas para el análisis de proteínas y enzimas, así como de aminogrupos provenientes de ellas. Introducción Las proteínas son polipéptidos. La palabra péptido comprende una amplia serie de compuestos que varían desde pesos moleculares bajos a muy elevados y muestran diferencias marcadas en cuanto a sus propiedades físicas, químicas y farmacológicas. Los miembros más inferiores derivan de sólo dos moléculas de aminoácidos, pero los superiores tienen muchas unidades de aminoácidos y forman PEPTIDOS, PROTEINAS SIMPLES (albúminas, globulinas, protaminas, glutalinas, entre otras) o PROTEINAS COMPLEJAS CONJUGADAS, en las cuales forman parte de la molécula otros grupos, por ejemplo hidratos de carbono en las mucoproteínas, fósforo en la caseína, lipoproteínas, etc. Todos estos compuestos más o menos complejos tienen dos o más moléculas de aminoácidos unidas por un enlace peptídico que resulta de la eliminación de agua, procediendo un OH - de un a.a. y un H de otro. Por lo tanto un dipéptido se formará así: R-CH(NH 2 )COOH + R*-CH(NH 2 )COOH R-CH(NH 2 )CO-NH-(COOH)CH-R* + H 2 O Los péptidos suelen definirse como sustancias de tipo proteínico que poseen PM por debajo de En las proteínas típicas el PM es mayor (30000 a en las prolaminas y glutelinas por ejemplo), y alcanzan valores muy elevados en las complejas, como las de la lana de oveja. ENZIMAS: en general son proteínas aunque se han encontrado algunas de distinta estructura. Poseen capacidad catalítica específica (aceleran una reacción química sin que éstas sufran cambios, al igual que un catalizador químico). Presentan lo que se conoce como especificidad por el sustrato (distinción entre una forma cis y una trans) y especificidad por la catálisis (sólo reduce, desamina). Ejemplos: Carbohidrasas: ej. amilasa, dextrinasa. Estearasas: ej. lipasa. Proteolíticas: ej. tripsina, papaína.

2 ACTIVIDADES PRÁCTICAS 1- Efectuar la reacción de Ninhidrina sobre las muestras de la droga vegetal en estudio obtenidas mediante el protocolo de preparación del extracto indicado en el Trabajo Práctico de Extracción. Reacción de la Ninhidrina: revela la presencia de aminogrupos primarios o secundarios. Se hace sobre papel de filtro. Se coloca una gota de la muestra o solución a ensayar sobre papel y se deja secar. Se agrega una cantidad similar de solución etanólica de ninhidrina al 0,2 % y paralelamente se hace un ensayo en blanco (reactivo solo) y uno del testigo (triptofano al 50 % en etanol) con el reactivo. Se calienta el papel en estufa ( ºC) hasta aparición de ligero color en el blanco. Se compara la intensidad de la mancha azul-violácea con la coloración de la solución testigo. 2- ELECTROFORESIS Las proteínas son polielectrolitos anfóteros que contienen al menos un grupo ácido (COOH) y otro básico (α-amino). La carga neta de una proteína determinada depende del ph del medio en que se disuelve. Si a una solución heterogénea proteica, tamponada, se le aplica un campo eléctrico, se producirá una migración diferencial de las proteínas en solución según su densidad de carga. Para ello se impregna una tira de papel de filtro con una solución buffer conductora sobre la que se depositan unos microlitros de la muestra en forma de mancha o banda angosta. Se aplica una diferencia de potencial entre los extremos de la tira, que están en contacto con los compartimentos de electrodos. La mancha o banda se extiende y se despliega cuando cada componente migra hacia uno u otro electrodo a una velocidad determinada principalmente por su movilidad electroforética. Después de dejar pasar el tiempo suficiente para una buena separación, la tira se quita y se seca. La posición de las bandas se detecta mediante reacciones de color o conteo radiactivo. Otra forma es realizar una electroforesis en geles de poliacrilamida en donde mediante el tratamiento con dodecil sulfato de sodio (SDS) todas las proteínas presentes en una muestra adquieren la misma densidad de carga, por lo que se logra entonces su separación de acuerdo a su masa molecular. 2.1) obtención de la muestra para realizar la electroforesis Pesar 1 g de droga, extraer con 10 ml de agua conteniendo EDTA al 1%, con agitación constante, a temperatura ambiente, durante 30 minutos. Filtrar y liofilizar el filtrado previamente congelado en freezer. 2.2) Electroforesis en geles de poliacrilamida ( SDS-PAGE) Se utilizará un equipo de Bio Rad Mini Protean II, que permite corre dos geles simultáneamente, uno de los cuales puede ser coloreado para la detección de proteínas con Coomasie blue, y el otro con el reactivo ácido periódico- Schiff (PA-S) para la visualización de los hidratos de carbono. Los geles pueden ser coloreados con plata a continuación de las coloraciones mencionadas anteriormente, a fin de lograr mayor sensibilidad en la detección.

3 Preparación de los geles. reactivos Componentes Cantidades Referencia Observación 1.-Buffer Tris base g Tris base: [ tris cationico Tricina 8,960 g (hidroximetil)amino Tris base 0.1 SDS 0,500 g metano] Tricina: N- M; Tricina [tris(hidroximetil)met 0.1 M SDS il] glicina 0.1 %) 2.-Buffer anionico: (Tris HCl 0,2 ; Ph 8,9) 3.-Gel buffer 4.-Buffer siembra simple buffer Tris base Tris HCl Agua grado HPLC, c.s.p Tris base Tris HCl SDS Agua grado HPLC, c.s.p Tris HCl, ph 6,8 2-mercaptoetanol Glicerol SDS (10% W/V) Azul de bromofenol al 0,05% w/v 21,180g 3,840g 100ml 25,170 14,550 g 0,300 g 100ml 1,0 ml 0,4 ml 0,8 ml 1,6 ml 0,2 ml Tris base: [ tris (hidroximetil)amino metano]hcl Debe conservarse a temperatura ambiente 5.-Tris HCl, ph 6,8 6.-SDS al 10% (w/v): 7.Acrilamida/ Bis Acrilamida (30%T; 2,67 % C)=monómer o Tris base agua obtenido por dilución de 10 g de dodecil sulfato en agua y ajuste del volumen a 100 ml. Acrilamida N,N -bis.metilen acrilamida Agua grado HPLC, c.s.p 6,000 g 60 ml 87,600 g 2,400 g 300ml Se ajusta el ph a 6,8 con ClH concentrado y se completa hasta un volumen final de 100ml con agua.debe conservarse en heladera, a temperaturas 4ºC La suspensión filtrada se conserva a4ºc, protegida de la luz, por no más de 30 días.

4 8.-APS 10%. al 9.-Colorantes para proteínas 10.Decolo--- - rante 11. reactivo de Schiff Solución de perdulfato de amonio al 10% w/v en agua desionizada calidad HPLC Solución al 0,1% (w/v),preparada por dilución del reactivo Coomasie Blue R- 250 en una mezcla constituida por metanol al 40% y ácido acético al 10% Mezcla formada por metanol al 40% y ácido acético al 12% en agua destilada, volumen final 100ml. Se prepara a partir de 0,1 g de fucsina que se coloca en 60ml de agua destilada. La mezcla se calienta hasta disolución completa, y luego se agrega 1g de sulfito de sodio anhidro disuelto en 10ml de agua destilasda y 1 ml de ClH concentrado. Fianalmente se completa a 100 ml el volumen de la solución con agua destiladfa y se deja durante al menos 1 hora en reposo antes de ser utilizado Procedimiento de preparación de los geles Los geles se arman en el soporte de armado ( casting stand ) según las instrucciones del manual Bio Rad. Se utiliza espaciadores de 0,75mm y peines de 10 calles. Se marca con un marcador para vidrio 1 cm por debajo del borde del peine ( 1 cm del gel concentrado, stacking gel ). A continuación se presenta una tabla ilustrativa de los componentes de los geles y las cantidades de cada uno recomendadas en cada caso. El orden están ubicados los reactivos corresponden al que debe seguirse durante el agregado de los mismos en el armado de los geles Reactivos SDS-PAGE(Gel separador) Gel 10% 16% concentrador 1 gel 2 geles 1 gel 2 geles 2 geles Monómero 2,0 ml 4,0 ml 3,2 ml 6,4 ml 0,66 ml H 2 O 1,2 ml 2,4 ml - - 3,10 ml Gel Buffer 2,0 ml 4,0 ml 2,0 ml 4,0 ml 1,24 ml Glicerol 0,65 ml 1,3 ml TEMED 5µl 10µl 5 µl 10 µl 6 µl APS 10% 50 µl 100 µl 50 µl 100 µl 60 µl

5 Preparación de las muestras y siembra. Las muestras insolubles o poco solubles (alrededor de 1 mg) se colocan en un tubo Eppendorff, se le agrega un volumen de buffer de siembra (30-50 µl) y se mantiene la mezcla durante 3 min a 90º C en baño de agua. Las mezclas pueden conservarse en freezer. Las muestras hidrosolubles pueden ser disueltas previamente en agua destilada (alrededor de 1 mg en 100 ml) y a partir de esta solución. Tomarse de 10 a 30 µl, y agregárseles un volumen igual de buffer de siembra procediendo luego como se indicó para los materiales insolubles. Una vez enfriadas las mezclas, se siembran en las calles correspondientes de los geles, hasta un volumen máximo de 30 µl Condiciones de corrida. Desarrollo en el gel concentrador: a 45 V. Desarrollo en el gel separador: se aumentan gradualmente desde 45 V hasta llegar a 110V como máximo y se deja en ese valor durante todo el resto de la corrida. Al finalizar la electroforesis y antes de abrir el sistema se baja el voltaje a 3 V Coloración de los geles para la localización de las proteínas. Una vez finalizada la corrida, se separan los geles y se colocan en un recipiente que contendrá la solución decolorante para fijar las sustancias separadas. Uno de los geles se transfiere a una cuba en donde se agrega el colorante Coomasie blue R250 preparado como se indicó anteriormente y se lo deja en contacto durante 1 h. a temperatura ambiente. Luego se procede al desteñido dejando el gel en contacto con la solución decolorante con cambios sucesivos de la misma hasta que solo se visualizan las bandas correspondientes a las proteínas y/o péptidos de color azul violáceo y el resto del gel se observe transparente. La coloración es estable si se conserva los geles en solución decolorante Coloración para la localización de hidratos de carbono. 1) Fijación: se efectúa sumergiendo el gel en ácido tricloroacético al 12,5% durante 2 h. a continuación el gel se lava exhaustivamente con agua destilada. 2) Oxidación: se incuba el gel durante 2 h en una solución de ácido periódico al 1% en ácido acético al 3%. Luego el gel se lava con abundante cantidad de agua destilada durante una noche. 3) Reactivo de Schiff: tras la oxidación y lavado, el gel es incubado durante 60 min con el reactivo. Finalmente se lava repetidamente con una solución acuosa de metabisulfito de sodio al 0,5% hasta que solo se visualiza las bandas color rosado correspondientes a los hidratos de carbono y desaparezca el color en el resto del gel. Los geles así coloreados son estables si se los mantiene en un baño de la solución decolorante (metabisulfito de sodio al 0,5%) Tinción con plata para proteínas e hidratos de carbono. 1) Los geles sin coloración previa, deben fijarse en una mezcla de metanol al 50% y ácido acético al 12% y los ya coloreados con Coomasie blue o con PA-Schiff, se matiene en el decolorante correspondiente. 2) Se lavan los geles fijados o decolorados, con etanol al 50%, tres veces, durante 20 min cada vez. 3) Se rehidrata los geles con abundante agua calidad HPLC evitando que el gel se vaya a la superficie o se doble.

6 4) Pretratamiento con Na 2 S 2 O 3 : se realiza con una solución de la sal pentahidratada al 25 (= 0,2 g/l), recientemente preparada, durante 1 min. 5) Se efectúan enjuagues con agua calidad HPLC (3 de 20s cada uno). 6) Impregnación: se utiliza una solución de nitrato de plata preparada con 200 mg por cada 100 ml, y 75 µl de formol al 37%, durante 20 min. 7) A continuación se realizan lavados con abundante agua calidad HPLC ( 2 de 20s cada vez). 8) Desarrollo: en una solución que contendrá por cada 10 ml, 6 g de carbonato de sodio 50µl de formol al 37% y 2 ml de solución preparada para efectuar el pretratamiento ( paso 4). Los geles se mantienen en esta mezcla 10 min. 9) Se lava con agua calidad HPLC ( 2 veces de 2 min en cada caso). 10) Se fija con una mezcla de metanol al 50% y ácido acético al 12%, durante 10 min. 11) Se lavan con abundante metanol al 50%. Por tiempos mayores a los 20 min cada vez. Se conserva a 4º C. IMPORTANTE: a) Rehidratar adecuadamente los geles ( paso 3). b) Mantener en todos los pasos los tiempos establecidos para lograr una correcta reproducibilidad de la técnica. c) Excepto los alcoholes diluidos las demás solciones deben preparase en el momento de ser usadas Determinación de las masas moleculares de las proteínas y/o glicoconjugados. Graficar Log de las masas moleculares de las proteínas de los estándar (márket de las masas moleculares) versus sus Rf. A continuación se miden los Rf de la/s proteínas y/o glicoconjugados de la muestra y se extrapolan en la muestra obtenida del márket. Se calcula entonces la masa moléculas aparente de cada sustancia de la muestra. BIBLIOGRAFIA - Treasse-Evans, Farmacognosia. 13º. Ed Interamericana Mc Graw Hill. - Dominguez, J.A., Métodos de investigación Fitoquímica México, Limusa. - Santomé, J. A., Microtécnica para la Purificación y Secuenciación de Péptidos y Proteínas UBA. - Flores,M.L., Estudio de las paredes celulares del alga roja iridaea undulosa Bory, Tesis doctoral, FCN, UNPSJB, 2000.

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