Describir el método para determinación de glifosato en suelos por Cromatografía Líquida de Alto Desempeño.
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- María Carmen Salinas Contreras
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1 Código: XXXXXX 31/12/2008 Versión: 01 Página 1 de 6 1. OBJETIVO Describir el método para determinación de glifosato en suelos por Cromatografía Líquida de Alto Desempeño. 2. ALCANCE DE LA APLICACIÓN Este método es aplicable a la determinación de glifosato en suelo por cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC) con derivatización postcolumna y detección por fluorescencia. Para confirmación de resultados se puede usar una columna cromatográfica de fase diferente a la analítica o una técnica de cromatografía de gas con detector selectivo de masas. 3. FUNDAMENTO TEÓRICO El glifosato es oxidado en un reactor post columna con cloruro de calcio para formar glicina, luego la glicina reacciona o-phthalaldehyde (OPA) en la presencia de mercaptoetanol (MERC) en un segundo reactor para formar un derivado fluorescente que luego es determinado en un detector de fluorescencia. 3.1 INTERFERENCIAS El glifosato se degrada por contacto con aguas cloradas. El glifosato también se absorbe fuertemente en minerales y superficies de vidrio. 4. ASPECTOS DE SALUD Y SEGURIDAD LABORAL Manipúlese con precaución muestras y reactivos, evitando el contacto con piel y ropa. Utilícese, bata, guantes de protección, gafas de seguridad, cabinas de extracción y máscara para vapores. 5. EQUIPOS 5.1 Agitador shaker. 5.2 Cromatógrafo Líquido de Alto Desempeño (HPLC), Detector de fluorescencia, reactor Post-Columna Cromatógrafo Líquido libre de pulsos o con sistema atenuador de pulsos que incluya bomba, inyector, horno calentador de columnas y sistema integrador de datos Detector de fluorescencia capaz de proveer 340 nm de longitud de onda de excitación y 425 a 455 nm de longitud de onda de emisión.
2 Código: XXXXXX 31/12/2008 Versión: 01 Página 2 de Columna cromatográfica con fase de intercambio aniónico 5 µm, 250 mm * 4 mm id) Reactor Post-columna: Sistema de derivatización dual que incluya dos reactores Centrifuga que permita realizar operaciones hasta rpm Rotavapor Placa de calentamiento Balanza analítica. 6. REACTIVOS 6.1 Hidróxido de Potasio, grado analítico. 6.2 Cloruro de Sodio, grado analítico. 6.3 Ortofosfato de Hidrógeno Dipotasio, grado analítico 6.4 Hipoclorito de Calcio, grado analítico. 6.5 Acido Bórico, grado analítico 6.6 Acido Clorhídrico, grado analítico 6.7 Acido Ortofosfórico, grado analítico. 6.8 Estándar certificado de Glifosato 98% pureza Solución intermedia: prepare una solución de 250 mg/l Prepare 5 estándares de calibración en un rango de 5 a 50 mg/l, que es el rango esperado de trabajo O-phthaldehyde (OPA), grado analítico mercaptoetanol (MERC), grado analítico Resina de intercambio catiónico del 8% unida a styrene divinylbenzene, malla seca , Dowex 50 W, Bio-Rad Laboratories Preparación y acondicionamiento de las columnas de intercambio catiónico: La resina de Dowex 50W fuertemente (50 g) fue introducida en una columna cromatográfica (19 mm de diámetro) como una suspensión con ácido clorhídrico 0,01 M y acondicionada con 200 ml de ácido clorhídrico 0,01 M a una velocidad de 2,5 ml/min Fase móvil: ácido Fosfórico 0,08 M Reactivo de oxidación: Pese 0,2 g de hipoclorito de calcio, 17 g de Ortofosfato de Hidrógeno y Potasio y 11,6 g de Cloruro de Sodio y disuélvalos en 1000 ml de agua desionizado y filtre a través de membrana de 0,22 ó 0,45 µm Reactivo de derivatización: Disuelva 100 g de ácido Bórico y 72 g de hidróxido de Potasio en 700 ml de agua desionizada en un matraz volumétrico de 1000 ml (esto tarda 1 a 2 horas). Añada 0,8 g de OPA disueltos en 5 ml de Metanol. Añada 2 ml de MERC y disuelva bien.
3 Código: XXXXXX 31/12/2008 Versión: 01 Página 3 de 6 7. MATERIALES E INSUMOS 7.1. Vidriería volumétrica de diferentes volúmenes Pipetas volumétricas de diferentes volúmenes Columna cromatográfica para limpieza de 19 mm ID * 220 mm Tubos de centrífuga 7.4. Recipientes plásticos para preparación de estándares Transferpipetas con puntas desechables Embudos de separación. 8. CONSIDERACIONES PARA LA TOMA DE MUESTRA Véase protocolo Toma y Preservación de Muestras y Limpieza de Material para Determinación de Plaguicidas Colecte en recipientes de polipropileno y refrigere a 4ºC Las muestras deben ser analizadas dentro de las dos semanas siguientes a la toma de muestra. 9. LIMPIEZA DE MATERIAL Véase protocolo Toma y Preservación de Muestras y Limpieza de Material para Determinación de Plaguicidas. NOTA: el glifosato se absorbe en las superficies del vidrio. Este fenómeno es especialmente pronunciado con las soluciones estándar, pero menos pronunciado cuando la matriz está presente y después de la derivatización. Prepare las soluciones con base a peso usando una balanza analítica. Use pipetas automáticas con puntas plásticas desechables, para el manejo adecuado de muestras y estándares. Calibre las pipetas automáticas como lo recomienda el fabricante. 10. PREPARACIÓN DE MUESTRAS Extracción a. Tome una porción de muestra de 20g en un recipiente con tapa de 250 ml. b. Añada 150 ml de Hidróxido de Potasio acuoso y llevar a agitación en shaker por 16 h, para desagregar el suelo.
4 Código: XXXXXX 31/12/2008 Versión: 01 Página 4 de 6 c. Decante el extracto en un beaker de 400 ml haciendo lavados con porciones de 10 ml de Hidróxido de Potasio 0,1 M al suelo remanente. d. Caliente el extracto por 1 minuto. e. Permita que se enfríe, y transfiera a tubos de centrifuga y centrifugue por 20 minutos a 7500 rpm. f. Filtre el sobrenadante a través de papel de fibra de vidrio para remover los sólidos suspendidos. g. Para muestras con alto contenido de material orgánico haga lavados con 2 porciones de 50 ml de Cloroformo en un embudo de separación y descarte los lavados. h. Nuevamente re-extraiga el remanente de suelo de la extracción por 6 horas aplicando el mismo procedimiento. i. Si espera una concentración baja de cationes extraíbles se pueden mezclar los dos extractos para realizar la limpieza. Si espera una concentración alta de cationes que supera la capacidad de intercambio de la columna se deben limpiar el primer y el segundo extracto separadamente. j. Evapore el extracto combinado a 50 ml en placa de calentamiento. k. Ajuste el ph a 2 con ácido clorhídrico 6 M. l. Centrifugue esta solución a 2500 rpm durante 10 minutos. m. Decante el sobrenadante claro en matraz de evaporación para rotavapor. n. Lave el sedimento del tubo de centrifuga con una porción de 25 ml de ácido Clorhídrico 0,01M y centrifugue a 2500 rpm por 10 minutos. o. Combine los extractos en el matraz de evaporación para rotavapor. p. Concentre el extracto a 5 ml en rotavapor a vacío a una temperatura de 60ºC. q. Ajuste el concentrado a ph 1,8-2,0 con ácido Clorhídrico 0,01 M, luego transfiéralo a un tubo de centrifuga y centrifugue a 2500 rpm por 10 minutos Limpieza a. Transfiera el extracto concentrado a la columna de intercambio catiónico acondicionada como se explicó previamente. Haga pasar el extracto a una velocidad de 2,5 ml/min. b. Lave la columna con porciones de ácido Clorhídrico 0,01 M hasta completar 45 ml y luego descártela. c. Eluya el Glifosato usando 2 porciones de 55 ml de ácido Clorhídrico 0,01 M. d. Lleve el extracto a sequedad en rotavapor a 60 ºC. e. Redisuelva el residuo en ácido Fosfórico 0,08 M y transfiéralo a un matraz volumétrico de 10 ml y llévelo a volumen. f. Pase la solución a través de papel filtro de acetato de celulosa de 0,45 µm antes de la determinación en HPLC.
5 Código: XXXXXX 31/12/2008 Versión: 01 Página 5 de PROCEDIMIENTO ANALÍTICO 11.1 Condiciones Cromatográficas Volumen de inyección: 50 µl Longitud de onda de emisión: 455 nm Longitud de onda de excitación: 340 nm Columna cromatográfica mantenida a 55 C. La fase móvil es ácido fosfórico 0,08 M a una tasa de flujo 0,5 ml/min. Reacción de oxidación post-columna a amina primaria a 55 C a un flujo de reactivo de oxidación de 0,3 ml/min Reacción de derivatización con OPA-MERC en un tubo de reacción de acero inoxidable (1m * 0,5 mm). 0,5 ml/min 12. METODOLOGÍA DE CÁLCULO Para calcular el contenido de glifosato en la muestra se aplica la siguiente ecuación: concentrat ion g / kg x V D x S : masa del analito (ng) calculada en la alícuota de la muestra introducida en el instrumento. V t : Volumen total del extracto concentrado (µl). Para purga y trampa Vt es 1. D : Factor de dilución, si la muestra o extracto fue diluido antes del análisis, si no se hizo dilución, el valor es 1. V i : Volumen de extracto inyectado en µl. El volumen de inyección nominal para las muestras y estándares de calibración deben ser la misma. Nota: si se usan unidades de concentración en el cálculo del factor de calibración, el factor Vi no debe ser tenido en cuenta en la ecuación. W : Peso de la muestra extraída o purgada en g. Se puede usar tanto el peso seco como s el peso húmedo, dependiendo de la aplicación que se le va a dar a los datos. s W t s V i 13. ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD ANALÍTICA Ver el documento Aseguramiento de la Calidad y Estandarización de Métodos Cromatográficos.
6 Código: XXXXXX 31/12/2008 Versión: 01 Página 6 de El límite de detección del método fue establecido por la referencia como 0,04 mg/kg En el desarrollo del método se probaron muestras (contenido de arcilla entre 25-87%) fortificadas en un rango de concentración 0,56 a 11,25 mg/kg para las cuales se obtuvo recuperaciones por encima del 80%. 14. PROPUESTA DE VALIDACIÓN DEL MÉTODO Ver el documento Aseguramiento de la Calidad y Estandarización de Métodos Cromatográficos. 15. BIBLIOGRAFÍA Pesticide Science, 40, The determination of Glyphosate in soils with moderate to High Clay Content
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