DETERMINACIÓN DE ÁCIDO FÓLICO EN HARINA DE TRIGO Método HPLC-DAD Basado en método Osseyi: Modificado

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1 Versión: 4 ME Página 1 de 8 1. OBJETIVO Determinar la concentración de ácido fólico por cromatografía liquida de alta resolución en fase reversa (HPLC) en harina de trigo fortificada. 2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE El método es aplicable a muestras de harina de trigo enriquecida o no con ácido fólico recepcionadas en la Sección Química de. 3. FUNDAMENTO El análisis se basa en la extracción del ácido fólico de la muestra de harina de trigo con buffer fosfato/acetonitrilo a ph alcalino, purificación con SPE y posterior identificación y cuantificación del ácido fólico por medio de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en fase reversa con detector DAD. La concentración se calcula interpolando en una curva de calibración en base a la relación del área de su pico versus concentración. 4. DOCUMENTOS DE REFERENCIAS 4.1 Rodney Hau. The analysis and stability of microencapsulated folic acid during the processing and preparation of instant Asian, noodles. School of Applied Sciences, Science. Engineering and Technology Portfolio. RMIT University, December Elolo S Osseyi, Randy L Wehling, Julie A Albrecht. Liquid chromatographic method for determining added folic acid in fortified cereal products. Journal of Chromatography A,826 (1998) TERMINOLOGÍA 5.1 Ácido fólico: La forma sintética y completamente oxidada de los folatos, un grupo de vitaminas solubles en agua que forman parte del grupo de vitaminas del complejo B. 5.2 SPE: Extracción en fase sólida de intercambio iónico (SAX). 5.3 SAX: Tipo de resina utilizada en la columna de SPE, cuyo principio es el intercambio aniónico (Strong Anion Exchange). DUEÑO DE PROCESO: Encargado de laboratorio Nutrientes, Aditivos y Contaminantes ESTE DOCUMENTO FUERA DE LA INTRANET O IMPRESO SIN TIMBRE DE DOCUMENTO CONTROLADO SE CONSIDERA COPIA NO CONTROLADA APROBADO: Jefe Subdepartamento Alimentos y Nutrición

2 ME Página 2 de 8 6. REACTIVOS, INSUMOS Y EQUIPOS 6.1 REACTIVOS Estándar de ácido fólico (*) PBS (Phosphate buffered saline Tableta, ph 7,2 7,6) Agua desionizada Ácido trifluoroacético (TFA) Acetonitrilo HPLC Hidróxido de Sodio (NaOH) p.a Ácido acético glacial Cloruro de sodio (NaCl) Fosfato ácido disódico anhidro (Na 2HPO 4) Cloruro de potasio (KCl) 6.2 INSUMOS Columna: Symmetry C-18, 5 µm, 4,6 x 250 mm (Waters) (*) Jeringa Hamilton para HPLC de 50 µl o muestreador automático Viales para HPLC de 1.5 ml de color ámbar con tapa y septa Tubos de SPE (SAX) 500 mg - 6mL Filtro Millipore para fase móvil (0.45 µm x 47 mm) Pipetas aforadas de 1, 3, 4 y 5 ml (o pipeta automática) Micropipetas de capacidad 20, 200 y 1000 µl Puntas de micropipeta Matraces aforados de color ámbar de 100 ml Matraces aforados de color ámbar de 10, 25, 100 y 250 ml Vasos de precipitados de 50 ml Frascos vidrio tapa rosca 1 L Probeta de 250 ml Tubos de centrifugación 50 ml Gradillas para tubos

3 ME Página 3 de Embudos de vidrio Piseta Navecillas para pesar Espátulas Pipetas Pasteur Etiquetas para tubos de ensayo Barras de agitación magnética 6.3 EQUIPOS Equipo HPLC con detector UV/DAD (*) Campana extractora de solvente Balanza analítica de 0.1 mg de resolución Balanza macroanalítica Baño de ultrasonido Centrífuga 3000 rpm refrigerada a 4 C Multivortex Bomba de filtración al vacio Equipo de filtración al vacío SPE Vacuum Manifold Sonicador Peachímetro (*) (*) Reactivos, insumos y equipos críticos 7. DESCRIPCIÓN DE ACTIVIDADES Antes de comenzar a trabajar con las muestras, asegurarse de la limpieza de su lugar de trabajo y que todo lo mencionado en punto materiales, insumos y reactivos esté disponible. A continuación se describe el método analítico, es crucial si no se dispone de práctica con el método, leer completo este procedimiento antes de comenzar a trabajar.

4 ME Página 4 de Muestreo/Muestra El ingreso de la muestra para su análisis debe cumplir con el instructivo de aceptación o rechazo de muestras IT Preparación de reactivos Estándares Solución madre de ácido fólico 100 µg/ml: Pesar 0.01 g de estándar de ácido fólico. Disolver en un poco de agua desionizada en un matraz aforado de color ámbar de 100 ml, agregar dos a tres gotas de solución de NaOH 10% hasta apreciar disolución del estándar (se torna de turbio a transparente) y aforar con agua desionizada. Considere la pureza del estándar para el cálculo de concentración final. Guardar solución congelada a 20 C, fuera del alcance de la luz. Duración máxima 1 mes. Soluciones Solución de fosfato buffer salino ph 7,4 (si no dispone de tabletas): Disolver 8 g de NaCl, 1.16 g de Na 2HPO 4 y 0.2 g de KCl en 1 litro de agua. Ajustar ph a 7.4 con NaOH al 10%. Este reactivo también existe en tabletas o en solución y se prepara según las instrucciones del fabricante. Buffer fosfato PBS solución buffer PBS ph 7,4 ± 0,2: Disolver una tableta de buffer PBS con 200 ml de agua desionizada o en igual proporción (para 1000 ml de agua agregar 5 tabletas). Esta solución asegura un ph 7,4 ± 0.2 (según información del fabricante). Solución de NaOH al 10%: Disolver 10,0 g de NaOH en 100 ml de agua desionizada. Solución buffer PBS ph 9,0 ± 0,2: Disolver una tableta de buffer PBS con 200 ml de agua desionizada o en igual proporción (para 1000 ml de agua agregar 5 tabletas). Ajustar ph hasta un valor de 9,0 ± 0,2 utilizando la solución de NaOH al 10 %. Solución de extracción buffer PBS ph 9,0 ± 0,2 + Acetonitrilo (95:5): Mezclar la solución buffer PBS ph 9,0 ± 0,2 con acetonitrilo en proporción 95 a 5, según la cantidad de muestras a trabajar, por ejemplo para dos muestras se utilizaran cerca de 100 ml aproximadamente. Esto quiere decir que para preparar 100 ml

5 ME Página 5 de 8 de solución de extracción se debe mezclar 95 ml de solución buffer PBS ph 9,0 ± 0,2 con 5 ml de acetonitrilo. Solución de lavado buffer PBS ph 7,4 ± 0,2 + acetonitrilo (80:20): Mezclar la solución buffer PBS ph 7,4 ± 0,2 con acetonitrilo en proporción 80 a 20 según la cantidad de muestras a trabajar, por ejemplo para dos muestras se utilizaran cerca de 50 ml aproximadamente. Esto quiere decir que para preparar 50 ml de solución de extracción se debe mezclar 40 ml de solución buffer PBS ph 7,4 ± 0,2 con 10 ml de acetonitrilo. Solución de elución ácido acético al 10 %: Agregar 10 ml de ácido acético glaciar a un matraz aforo de 100 ml, llevar a volumen con agua desionizada. Preparación de la fase móvil TFA al 0,1% - acetonitrilo (88:12): Agregar 1 ml de TFA a un matraz aforo de 1000 ml, llevar a volumen con agua desionizada, Mezclar con probeta en un frasco Shott de 1000 ml, 880 ml de TFA al 0,1 % con 120 ml de acetonitrilo. Si el equipo HPLC cuenta con bomba cuaternaria programarlo para que este realice en forma automática la mezcla en igual proporción. 7.3 Preparación de curva de calibración. Realizar curva de calibración que contenga los 5 niveles; 0.05, 0.1, 0.2, 0.4 y 0.8 µg/ml. Preparar la curva según la tabla y llevar a volumen con agua desionizada. Concentración µg/ml Alícuota µl Volumen final ml Concentración inicial µg/ml Nota: Una vez preparados los puntos de la curva de calibrado, estos deben ser sometidos a extracción en fase sólida (SPE) o (EFS). Es decir deben ser sometidos a igual proceso de clean up que una muestra, adicionando 6 ml de cada estándar de trabajo sobre la columna de extracción, lavando con solución de lavado y eluyendo con 3 ml ácido acético al 10% cada uno, luego estos extractos son inyectados al HPLC para confeccionar la curva de calibrado.

6 ME Página 6 de Preparación de controles Utilizar material control (Quality Control), destinado para ello y que corresponde a Harina de Trigo homogeneizada y de valor conocido. 7.5 Preparación de la Muestra o etapas previas a realizar la medición Pesar g de la muestra de harina de trigo previamente homogeneizada en un tubo de centrifugación (tubo Falcon) de 50 ml Agregar 20 ml de la solución de extracción buffer PBS ph 9,0 ± 0,2 + acetonitrilo (95:5), agitando rápidamente para que no se formen grumos Sonicar por 15 minutos Agitar en multivortex por 15 minutos a máxima revolución Centrifugar 5 minutos a 5000 rpm Purificación de la muestra con SPE Activar la columna con 5 ml de acetonitrilo Añadir 5 ml de solución buffer PBS ph 7,4 ± 0, Agregar 6 ml de muestra centrifugada Lavar la columna con 5 ml de solución de lavado buffer PBS ph 7,4 ± 0,2 + acetonitrilo (80:20) Dejar secar Eluir la columna con 3 ml de ácido acético glacial al 10 % e inyectar al HPLC-DAD. 7.6 Análisis de la muestra o realización de la medición. Condiciones instrumentales. Columna: Symmetry C-18, 5 µm, 4,6 x 250 mm (Waters) Temperatura de la columna: 40 C Detector: DAD (longitud de onda = 280 nm) Fase móvil: Fase móvil TFA al 0,1% - acetonitrilo (88:12), modo isocrático. Flujo: 1.0 ml/minuto Tiempo de corrida: 8 minutos. 7.7 Cálculo de Resultados: Ingresar al HPLC, cargar método: A_FOL_DAD.M el cual contiene la curva de calibración obtenida de concentración (C) en µg/ml e interpolar la muestra para cuantificar el resultado del área vs concentración. Valor C (µg/ml). C * vf mg/kg de ácido fólico = a

7 ME Página 7 de 8 Donde: c = concentración en µg/ml obtenido por la interpolación en la curva de calibración de la muestra. vf = volumen de la muestra final (20 ml para la presente técnica) a = masa de la muestra en gramos 7.8 Aseguramiento de la calidad del ensayo. Se efectuarán controles sistemáticos y periódicos para comprobar la validez de los ensayos realizados con el método analítico recogido en este procedimiento. a) Ensayos de intercomparación, utilización de materiales de referencia certificados y patrones de referencia certificados, según disponibilidad. b) Durante el desarrollo de la serie de trabajo se incluye: - Control de blanco al inicio de la corrida cromatográfica - Material Control en Duplicado. - Control de estándar de concentración conocida sin SPE - Control de estándar de concentración conocida con SPE 7.9 Expresión de los Resultados. Informar el resultado mg/kg de ácido fólico con un decimal Los desechos alimentarios en buen estado son eliminados por basura normal, considerando el volumen de alimentos y criterio de la Jefatura correspondiente. Los desechos expuestos a alguna contaminación biológica o química y desechos producto del proceso, serán eliminados de acuerdo al procedimiento de Gestión de Residuos (PR ) e instructivo Manejo de Residuos peligrosos, especiales y otros (IT ).

8 ME Página 8 de 8 8. CONTROL DE REGISTROS IDENTIFICACION RESPONSABLE TIEMPO ALMACENAMIENTO MEDIO SOPORTE LUGAR RESPONSABLE/ RECUPERACION DISPOSICION Muestras ácido fólico RG-001-ME Encargado de laboratorio 5 años Electrónico Carpeta compartida sección química de alimentos Eliminación de archivos 9. CONTROL DE CAMBIOS VERSION FECHA PRINCIPALES PUNTOS MODIFICADO S RESUMEN DE MODIFICACIONES 3 26/05/ Se incluyen insumos críticos. 3 26/05/ Se incluye limpieza del lugar de trabajo. 3 26/05/ Se incluyen puntos bajo de la curva. 3 26/05/ Se incluye eliminación de desechos. 3 26/05/ Se incluye registro digital. 10. CUADRO DE RESPONSABILIDADES Responsabilidades con la ejecución del Método Ejecuta el método Técnico de Laboratorio Encargado de Laboratorio Nutrientes Aditivos y Contaminantes Elabora el informe de resultados Profesional encargado del Laboratorio Aprueba el informe de resultados Jefatura de Sub departamento Alimentos y Nutrición 11. ANEXOS No Aplica.