DETERMINACIÓN DE OCRATOXINA A Método HPLC (Columna inmunoafinidad) ME
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- Martín Paz Benítez
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1 Página 1 de 9 1. OBJETIVO Detectar y cuantificar la presencia de ocratoxina A en alimentos 2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE El método es aplicable a cereales y sus derivados, café verde, café tostado, cacao, merquen y pasas 3. FUNDAMENTO Se basa en la extracción de la micotoxina con distintos solventes de acuerdo a la matriz, purificación en columnas de extracción en fase sólida (inmunoafinidad) y cuantificación por HPLC usando detector de fluorescencia 4. DOCUMENTOS DE REFERENCIAS 4.1 The comparison of two clean-up procedures, multifunctional column and inmunoaffinity column, for HPLC determination of ochratoxin A in cereals, raisins and green coffee beans. Sugita- Konishi et.al. Talanta 69(2006) Aflatoxin and Ochratoxin A contamination of retail food and intake of these mycotoxins in Japan. Kumagai et.al. Food Additives and Contaminants Vol 25 nº9, September 2008, Co-occurrence of ochratoxin A and aflatoxins in chocolate marketed in Brazil. Copeti et.al. Food Control 26 (2012) TERMINOLOGÍA 5.1 Ocratoxina A: Micotoxina que se origina principalmente de dos especies fúngicas, Aspergillus ochraceus y Penicillium verrucosum. Su ingesta crónica puede provocar cancer hepático y renal. 5.2 LC/MSMS: Cromatografía líquida acoplada a detección por masas-masas. DUEÑO DE PROCESO: Encargada de laboratorio de Toxinas Marinas y Micotoxinas ESTE DOCUMENTO FUERA DE LA INTRANET O IMPRESO SIN TIMBRE DE DOCUMENTO CONTROLADO SE CONSIDERA COPIA NO CONTROLADA APROBADO: Jefe Subdepartamento y Nutrición
2 Página 2 de 9 6. REACTIVOS, INSUMOS Y EQUIPOS 6.1 REACTIVOS Antes de comenzar a trabajar con las muestras, asegurarse de que todos los reactivos mencionados a continuación están disponibles, además preparar las soluciones descritas antes de comenzar y disponerlas en el mesón de trabajo: Estándar de Ocratoxina A (OTA) (crítico) Acetonitrilo, grado HPLC (crítico) Metanol, grado HPLC (crítico) Ácido acético glacial (crítico) Bicarbonato de sodio p.a. (crítico) PBS (Solución de fosfato de buffer salino): Ver preparación en punto Cloruro de Sodio p.a Acetato de Amonio 10 mm Polietilenglicol 800 (PGE 800) Solución Tolueno-Ácido acético 99: Agua desionizada (crítico) Tween 20 (crítico) Nitrógeno 6.2 INSUMOS Antes de comenzar a trabajar con las muestras, asegurarse de que todo lo mencionado a continuación esté disponible e idealmente disponer de los materiales en el mesón de trabajo: Columnas de inmunoafinidad (OchraTest WB Vicam o similar) Erlenmeyer ámbar con tapa de 250 ml Viales ámbar de 2 ml para autosampler Papel filtro Whatman Nº 4 o equivalente, y filtro Whatman 934 AH Micropipetas de 200 y 1000 µl Matraces de aforo 10 ml ámbar Viales ámbar silanizados de 4 ml
3 Página 3 de EQUIPOS Balanza analítica 0.1 mg Balanza de precisión 0.01g Equipo HPLC con detector de fluorescencia Equipo LC/MSMS 3200 Q Trap Blender / shaker / juguera Sistema Manifold para columnas SPE Sonicador Sistema concentrador a base de nitrógeno Baño termoregulado Agitador orbital 7. DESCRIPCIÓN DE ACTIVIDADES Antes de comenzar a trabajar las muestras, asegurarse de que todo lo mencionado en punto reactivos e insumos esté disponible. A continuación se describe el método analítico, es crucial si no dispone de práctica con el método, leer completo este procedimiento antes de comenzar a trabajar. Es necesario utilizar guantes para este trabajo como medida de bioseguridad. 7.1 MUESTREO / MUESTRA: Chequear que antecedentes de la muestra en guía de ingreso coincidan con los rotulados en la muestra. Registrar la recepción de la muestra en el cuaderno Registro de análisis de toxinas marinas y micotoxinas RG Almacenar la muestra a temperatura ambiente, evitando lugares húmedos, para conservar características originales de la muestra Al finalizar el trabajo y una vez informada la muestra, si la cantidad restante lo permite, almacenar aproximadamente 10g de contramuestra y eliminar lo restante. 7.2 PREPARACIÓN DE REACTIVOS PBS (Solución de fosfato de buffer salino): Disolver 8 g de NaCl, 1.16g de Na 2 HPO 4 y 0.2g de KCl en 1 litro de agua. Ajustar ph a 7.4 con NaOH 0.2 M. Este reactivo también existe en tabletas y se prepara según las instrucciones del fabricante.
4 Página 4 de PREPARACIÓN DE CURVA DE CALIBRACIÓN Preparar soluciones de trabajo a partir de la solución intermedia de 100 ppb. Utilizar al menos 3 puntos. Tomar las alícuotas correspondientes, evaporar con nitrógeno y reconstituir en fase móvil Registrar preparación de estándares en RGG Registro preparación de soluciones estándares puras 7.4 PREPARACIÓN DE CONTROLES Se recomienda preparar un fortificado a partir de una muestra con adición de estándar a 5 ug/kg o bien utilizar un material de referencia (Remanente de ensayo de interlaboratorio por ejemplo) 7.5 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA O ETAPAS PREVIAS A REALIZAR MEDICION Homogenizar la muestra Según la tabla N 1, elegir el peso y la solución extractante de acuerdo a la matriz a analizar. Si la cantidad de muestra no permite pesar lo indicado, pesar mínimo 5g en un tubo de centrífuga de 50 ml y agregar el proporcional de solución extractante (Ejemplo: Café tostado 2.5 g, solución extractante 10 ml) TABLA N 1 Matriz Peso (g) Volumen (ml) Solución extractante Café verde 25 g MeOH 1% NaHCO3 (7:3) 100 ml Cacao, merquén 25g MeOH 1% NaHCO3 (7:3) 200 ml Café tostado 25 g 1% NaHCO3 (7:3) 200 ml Avena, Arroz, Maíz y derivados Trigo, Harina de centeno Pasas 25 g NaCl 5 g a la muestra MeOH-H2O (8:2) 100 ml 25 g CH3CN H2O (6:4) 100 ml 45 g hidratados (25 g de pasas molidas con 20 ml de agua) MeOH 1% NaHCO3 (7:3) 80 ml Pesar en matraz ámbar con tapa de 250 ml y agitar por 30 minutos o mezclar a alta velocidad por 3 minutos en juguera. Para muestras pequeñas (2.5g) agitar 30 minutos en agitador orbital Filtrar a través de filtro Whatman N 4 o equivalente. Recolectar el filtrado en matraz ámbar con tapa. En el caso de pesar 2.5g. centrifugar el extracto a 3000 RPM por 15 minutos En el caso de muestras de café verde, pasas y cereales, tomar 10 ml del filtrado y llevar a 50 ml con la solución de fosfato de buffer salino (PBS). Si no fuese posible
5 Página 5 de 9 tomar 10 ml, tomar 5 ml y llevar a 25 ml con PBS. Para muestras de cacao, café tostado y merquén, tomar 10 ml del filtrado y llevar a 50 ml con solución de fosfato de buffer salino (PBS) más Tween 20 al 0.01%. Si no fuese posible tomar 10 ml, tomar 5 ml y llevar a 25 ml con PBS más Tween 20 al 0,01% Filtrar por filtro Wathman 934 AH glass filter. Si las soluciones no son transparentes, volver a filtrar Preparar columnas de inmunoafinidad previo a su instalación en el manifold, para ello, hacer una pequeña perforación con una aguja en la tapa superior de la columna (para eliminar burbujas), luego retirar las tapas (inferior y superior) de la columna y conectar en el manifold Permitir la salida del líquido que contiene la columna (comenzará a bajar). Detener el flujo cerrando la llave del manifold cuando el menisco alcance el tope del relleno (evitar que el relleno de la columna se seque) Agregar 2 veces el volumen de columna de PBS y dejar pasar todo el volumen para retirar los conservantes que ésta contiene. Agregar una tercera vez PBS pero cortar su paso en la mitad de la columna Colocar adaptador a entrada de columna y conectar reservorio de muestra Llenar reservorio con 20 ml de muestra y dejar pasar por la columna a flujo constante (Por gravedad). Evitar que el relleno de la columna se seque. Si se utilizan columnas Ochratest 1 ml de volumen, agregar sólo 10 ml de muestra Lavar la columna 10 veces con PBS manteniendo el flujo constante. La cantidad de veces que se lave la columna dependerá de que se logre observar que el color del relleno disminuya Lavar con 3 ml de acetato de amonio 10 mm por tres veces, saltar este paso para el cacao y el merquén Con una jeringa, usando adaptador, hacer pasar aire en forma suave para compactar el relleno de la columna Colocar los viales ámbar de 4 ml silanizados bajo cada columna. Eluir la ocratoxina con 1 ml de MeOH-CH 3 COOH 98+2, esperar 5 minutos luego de eluida Repetir el proceso dos veces más. No es necesario esperar 5 minutos Evaporar a sequedad los 3 ml bajo corriente de Nitrógeno en un baño a 45 C Reconstituir con 1 ml de fase móvil Colocar en viales de autosampler para su determinación y cuantificar por HPLC. 7.6 ANALISIS DE LA MUESTRA O REALIZACIÓN DE LA MEDICIÓN. CONDICIONES INSTRUMENTALES Condiciones cromatográficas: Columna Purospher STAR RP-18e (5um), 250 mm, 4,6 mm Flujo 1 ml/minuto Excitación : 333 nm Emisión 460 nm Temperatura horno de columna: 45 C
6 Página 6 de 9 Volumen inyectado : 100 ul Fase móvil: CH 3 CN H 2 O CH 3 COOH (55:43:2) 7.7 CÁLCULO DE RESULTADOS Para obtener el resultado de Ocratoxina A en la muestra en ng/g (ppb) proceder a aplicar la siguiente fórmula de cálculo: C mta ng/g = Conc HPLC * (V solext /P mta ) * (V final dilución/ V inicial dilución) * (Vfinal reconst/v IAC ) Donde: C mta ng/g = Concentración de Ocratoxina A en la muestra en ppb Conc HPLC = Concentración entregada por el HPLC en ng/ml V solext = Volumen de solución extractante utilizado en ml P mta = Peso de la muestra en gramos V final dilución = Volumen final de la dilución con PBS (o PBS y tween 20) (50 ml) V inicial dilución = Alícuota de extracto a diluir (10 ml) Vfinal reconst = Volumen final de reconstitución (1 ml) = Volumen de extracto en ml pasado por la columna de inmunoafinidad V IAC 7.8 ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD DEL ENSAYO Se efectuarán controles sistemáticos y periódicos para comprobar la validez de los ensayos realizados con el método de ensayo recogido en este procedimiento. Los controles de calidad quedan agrupados en tres niveles de control: a. Nivel I: Ensayos de intercomparación, utilización de materiales de referencia certificados y patrones de referencia certificados, según disponibilidad. b. Nivel II: Materiales de referencia sin certificación externa y muestras fortificadas por el analista. CONFIRMACIÓN En el caso de determinar que una muestra contiene una cantidad de ocratoxina superior a la permitida por el Codex Alimentarius (5 ppb) se deberá confirmar su presencia si es posible por medio de LC/MSMS. Para ello se deberá reconstituir la muestra luego de evaporada en 250 ul de la mezcla de la Fase móvil para LC/MSMS 1+1 B+A y filtrar antes de inyectar por filtro 0.22 um Cromatógrafo Líquido: - Temperatura del horno de columna: 40ºC
7 Página 7 de 9 - Temperatura de la muestra: 10ºC - Flujo: ml/min - Volumen de inyección: 25 ul - Tiempo de análisis: 10 min. - Columna: XDB Agilent 3.5*150*2.1 - Fase móvil: Acuosa: 0.5% Ácido acético en Agua HPLC Orgánica: 0.5% Ácido acético en Acetonitrilo HPLC -Gradiente: Tiempo (min) A% B% 0, , , , , , Espectrómetro de masas: El método tiene los siguientes parámetros fuente de iones: Tipo de scan: MRM ESI: Positivo CUR: CAD: 6.00 IS (Volt): GS1: GS2: Temp (ºC): Interface: ON Método de Masas: Se monitorizan 2 canales o transiciones para cada compuesto. En la siguiente tabla se incluyen el dwell (dwell time en segundos), DP, EP, CEP, CE y CXP.
8 Página 8 de 9 Método de masas Transición Dwell DP EP CEP CE CXP Compuesto 404/ Ocratoxina A 404/ Ocratoxina A 7.9 EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS La forma como se expresan los resultados en el informe de ensayo es en ppb de Ocratoxina A. 8. CONTROL DE REGISTROS IDENTIFICACION RESPONSABLE TIEMPO RGG Registro preparación de soluciones estándares puros Técnico y profesional del laboratorio ALMACENAMIENTO MEDIO SOPORTE 5 años Papel LUGAR RESPONSABLE/ RECUPERACION Laboratorio de Toxinas marinas y micotoxinas/ Carpeta de estándares DISPOSICION Picado en trozos, basura normal RG Registro de análisis de Toxinas marinas y micotoxinas Técnico y profesional del laboratorio 5 años Papel Laboratorio de Toxinas marinas y micotoxinas/ Cuaderno foliado Picado en trozos, basura normal 9. CONTROL DE CAMBIOS VERSION FECHA PRINCIPALES PUNTOS MODIFICADOS RESUMEN DE MODIFICACIONES Se modifica documento a nuevo formato institucional 3 Referencias Se incluye nueva referencia 3 Preparación de la muestra Se incluye tratamiento para nuevas matrices (Cacao, café tostado y merquén)
9 Página 9 de CUADRO DE RESPONSABILIDADES Responsabilidades con la ejecución del Método Ejecuta el método (Cargo) Técnico o Encargado de Laboratorio 11. ANEXOS No Aplica Elabora el informe de resultados (Cargo) Encargado de Laboratorio Aprueba el informe de resultados (Cargo) Jefe de Sección
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