DETERMINACION DE HIDROXIMETILFURFURAL EN MIELES. Método por HPLC con detección UV ME
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- José Antonio Cano Valdéz
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1 Página 1 de 5 1. OBJETIVO Determinación del contenido de Hidroximetilfurfural (HMF) en miel de abejas. 2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE El método permite determinar HMF, el cual es un producto de deshidratación de monosacáridos presentes en la miel, que sirve como indicador de la longevidad de la miel o bien para juzgar las condiciones de procesado y almacenamiento de este producto. Este método permite cuantificar HMF en mieles de diverso origen (mieladas, mono o multiflorales). 3. FUNDAMENTO La presente metodología tiene como principio realizar un cribado de la muestra, donde la muestra es sometida a una extracción de fase sólida, para obtener la fracción limpia. La muestra es determinada por HPLC, utilizando fase estacionaria reversa y detectada a 284 nm. 4. DOCUMENTOS DE REFERENCIAS 4.1 Drieffield M., Chan D., Macarthur R., Macdonald S., and Bereton P., Single laboratory validation of a Mthod for the determination of Hydroxymethylfurfural in honey by using solid-phase extraction cleanup and liquid chromatography. Journal of AOAC International, vol 88, 1 p TERMINOLOGÍA 5.1 DAD: Detector de arreglo de diodos. 5.2 HMF: Hidroximetilfurfural 5.3 HPLC: Cromatografía liquida de alta resolución. 5.4 SPE: Extracción en fase sólida. 5.5 UV: Espectro ultra violeta 6. REACTIVOS, INSUMOS Y EQUIPOS 6.1 REACTIVOS Agua destilada Acetonitrilo (ACN) grado HPLC Agua grado HPLC DUEÑO DE PROCESO: Encargado de Laboratorio de Nutrientes, Aditivos y Contaminantes. ESTE DOCUMENTO FUERA DE LA INTRANET O IMPRESO SIN TIMBRE DE DOCUMENTO CONTROLADO SE CONSIDERA COPIA NO CONTROLADA APROBADO: Jefe Subdepartamento
2 Página 2 de Metanol grado HPLC Estándar de Hidroximetilfurfural 6.2 INSUMOS Espátulas Papel absorbente Plumón permanente Gradillas Micropipetas de 200, 1000 y 5000 ul Piseta Tubos con tapa de 15 y 50 ml Viales para automuestreador del cromatografo Cartuchos de extracción en fase solida con resina C18 de 500 mg Columna para HPLC: RP x 4.6 x 5 um o equivalente. 6.3 EQUIPOS Balanza de precisión, con resolución de 0,001 g Cromatografo líquido con detector UV ó DAD Agitador orbital Sistema de extracción en fase solida con manifold Bomba de vacío de 1HP. 7. DESCRIPCIÓN DE ACTIVIDADES 7.1 Muestreo/Muestra El ingreso de la muestra para su análisis debe cumplir con el instructivo de aceptación o rechazo de muestras según IT Preparación de Reactivos Estándares Solución madre de HMF 500 ug/ml. Pesar 12,5 mg de HMF y llevar a 25 ml con una mezcla ACN/agua 1:9, considere la pureza del estándar para determinar la concentración final de la solución.
3 Página 3 de 5 Solución de HMF de 100 ug/ml: tomar 2 ml de solución de 500 ug/ml y llevar a 10 ml con ACN/agua 1: Soluciones Solución de elusión: para 100 ml, mezclar 10 ml de acetonitrilo HPLC con 90 ml agua HPLC, desgasificar antes de usar. Fase móvil: para 1 litro, mezclar 80 ml de acetonitrilo HPLC con 920 ml de agua HPLC. Desgasificar antes de usar. 7.3 Preparación de curva de calibración Realizar curva de calibración a 5 niveles según la tabla y llevar a volumen con ACN/agua (1:9). Concentración ug/ml Alícuota ul Volumen final ml Preparación de controles Para material control proceder como muestra normal. 7.5 Preparación de la Muestra o etapas previas a realizar la medición. Concentración inicial ug/ml Si la muestra presenta partículas, retírelas con una espátula, y de ser posible, homogeneizar la muestra antes de su obtención. Bajo ninguna circunstancia calentar la miel durante el procedimiento, ya que invalidaría el método Pesar 5 + 0,3 g de muestra, en duplicado y con precisión de 0,01 g, en tubos con tapa de 50 ml Añadir agua desionizada llevando a 25 ml cada tubo Tomar una alícuota de 1 ml de la disolución y diluirla con 9 ml de agua desionizada Montar el sistema de SPE y acondicionar los cartuchos con 1 ml de metanol, seguido de 3 ml de agua desionizada Cargar 2 ml de la disolución de la muestra al cartucho Lavar el cartucho con 2 ml de agua desionizada Secar el cartucho con un volumen aproximado de 25 ml de aire Eluir la muestra con 4 ml de la solución de elusión y luego pasar un volumen de aire por el cartucho, para asegurar que la extracción total de la muestra. Tapar el vial y agitar en vortex por 10 segundos Diluir 1,5 ml del eluato con 0,5 ml de agua desionizada. Tapar el vial y agitar en vortex por 10 segundos. Transferir a un vial de autosampler ámbar para su análisis.
4 Página 4 de Análisis de la muestra o realización de la medición. Condiciones instrumentales. Cromatografo líquido con detector UV ó DAD, Columna: RP x 4,6 x 5 m Fase móvil: Acetonitrilo/Agua 8:92 Flujo: 1 ml/min Temperatura: 20 C Tiempo de retención de HMF 5,8 min aprox. Volumen de inyección: 50 L Longitud de onda: 284 nm 7.7 Cálculo de Resultados: C x 5 HMF (mg/kg) = m x 0,0075 Donde: C = Concentración obtenida de la curva de calibrado en ug/ml. 0,0075 = factor de dilución 5 = porción de ensayo nominal. m = masa pesada en gramos 7.8 Aseguramiento de la calidad del ensayo. Se realizarán los siguientes ensayos según disponibilidad: Ensayos de intercomparación o utilización de materiales de referencia certificados o patrones de referencia certificados Durante la serie de trabajo incluir: Control de blanco al inicio de las lecturas (para estándar de referencia) Control de estándar de concentración conocida Lectura del estándar como control por cada 10 muestras leídas. 7.9 Expresión de los Resultados. Debe informarse la concentración de HMF en la muestra como mg/kg de producto.
5 Página 5 de 5 8. CONTROL DE REGISTROS IDENTIFICACION RESPONSABLE TIEMPO RG Registro para análisis químico en alimentos Encargado de laboratorio de Nutrientes, Aditivos y Contaminantes ALMACENAMIENTO MEDIO SOPORTE 5 años papel LUGAR RESPONSABLE/ RECUPERACION Laboratorio de Nutrientes, Aditivos y Contaminantes / Libro anillado con páginas foliadas DISPOSICION Eliminación a basura común posterior a 5 años 9. CONTROL DE CAMBIOS VERSION FECHA PRINCIPALES PUNTOS MODIFICADOS RESUMEN DE MODIFICACIONES Se modifica el número del IT, actualmente es IT Todos Cambio de formato. El documento para de PRT a Se corrige formula de calculo 0 8 Se incluye código de registro. 10. CUADRO DE RESPONSABILIDADES Ejecuta el método Técnico de Laboratorio Encargado de Laboratorio Nutrientes Aditivos y Contaminantes Elabora el informe de resultados Profesional encargado del Laboratorio Aprueba el informe de resultados Jefatura de Sub departamento Alimentos y Nutrición 11. ANEXOS No Aplica.
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