PROCEDIMIENTO DETERMINACIÓN DE RESIDUOS DE PLAGUICIDAS ORGAFOSFORADOS, TRIAZOLES Y PIRETROIDES EN FRUTAS Y VERDURAS POR GC MS

Transcripción

1 PRT Página 1 de OBJETIVO Determinar residuos de plaguicidas organofosforados, triazoles y piretroides en frutas y verduras por método cromatografía gaseosa con detector selectivo de masas. 2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE El método es aplicable a muestras de frutas y verduras de consumo humano recepcionadas en la Sección Química de del Subdepartamento. 3. FUNDAMENTO Se basa en la extracción de residuos de plaguicidas en muestras sin grasas y alto contenido de humedad con acetonitrilo. La mayoría de los residuos no iónicos son extraídos en la solución acetonitrilo adicionando cloruro de sodio y buffer fosfato ph= 7.0, para luego realizar limpieza con columna SAX/PSA, eluyendolos con acetona-hexano para su determinación. 4. REFERENCIAS 4.1. Método Multiresiduo para plaguicidas por GC-MS, Método Oficial Japonés Multiresidue Method for the Determination of Residues of 251 Pesticides in Fruits and Vegetable by Gas Cromatography/ Mass Spectrometry. (2000) J. AOAC int, Vol 83, Elaborado por Revisado por Aprobado por Marcelo Soto T.M. Mariana Fernandez Emilia Raymond Encargado Laboratorio de Encargada de Calidad Depto Jefa Sección Química de Residuos Plaguicidas y Toxicología

2 PRT Página 2 de TERMINOLOGÍA 5.1. G.C = Cromatografía gaseosa MSD = Detector selectivo de masas 5.3. ppm = Una parte por millón, mg/kg o mg/l SIM = Single ion monitoring 5.5. EI = Electronic ionization 6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS 6.1 MATERIALES E INSUMOS Columna cromatográfica HP-5MS 30 m x 0.32 mm x 0.50 µm Papel filtro Nº 5 A 150 mm Columna de extracción en fase sólida SAX/PSA, 500 mg mg adsorbente Matraz de aforo de 100 ml ± 0.02 ml (20 C), clase A Embudos de decantación con tapa de 125 ml Embudo de porcelana Buchner 125 mm Balón evaporación fondo redondo de 50 y 100 ml Probeta de 10, 50, 100 y 1000 ml (20 C), clase A Micropipeta intervalo de µl Pipeta total vidrio de 0.5 ml ± (clase A) Pipeta total vidrio de 4 ml ± (clase A) Pipeta total vidrio de 10 ml ± 0.02 (clase A) Pipetas Pasteur de 3 ml Vaso precipitado 100 y 250 ml Matraz Erlenmayer 125 ml Tubos de vidrio con tapa de 15 ml Viales de 2 ml para autosampler Envase de vidrio ámbar de 1000 ml con tapa rosca Espátula Piseta de propileno.

3 PRT Página 3 de REACTIVOS Acetonitrilo grado residuos Acetona GC grado residuos Hexano GC grado residuos 95-98% pureza Agua desionizada Sulfato de sodio anhidro grado plaguicidas Fosfato de potasio dibásico (K2HPO4) Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4) Cloruro de sodio p.a Hidróxido de sodio p.a Ácido clorhídrico p.a 6.3 EQUIPOS Cromatógrafo Gaseoso Refrigerador para almacenar estándares intervalo entre 2 y 8 C Refrigerador para almacenar muestras entre 2 y 8 C Campana con extractor de gases corrosivos Balanza analítica Agitador automático de embudos de decantación Homogeneizador de acero Blender o similar Rotavapor con baño termorregulado 40 ºC ± 2 ºC Evaporador con corriente de nitrógeno Manifold de extracción Bomba de vacío.

4 PRT Página 4 de DESARROLLO 7.1 PREPARACIÓN DE REACTIVOS Preparación de soluciones a) Solución de acetona/hexano (3:7) (v/v) : Adicionar 300 ml de acetona en una probeta graduada de 1 L, adicionar 700 ml de hexano, mezclar por 15 segundos, dejar reposar por 1 minuto y trasvasijar el contenido a un envase ámbar de 1 L previamente ambientado y sellar. Esta solución debe prepararse al momento del análisis b) Hidróxido de Sodio 1 M: Disolver 4 g de hidróxido de sodio con agua desionizada y enrasar a 100 ml en matraz aforado. Duración mínima 1 año y debe conservarse a temperatura ambiente. c) Ácido Clorhídrico 1 M: Adicionar cuidadosamente 0,8 ml de ácido clorhídrico a un matraz de 100 ml que contiene 50 ml agua desionizada. Enrasar a 100 ml con agua desionizada. d) Tampón Fosfato 0.5 M ph 7.0: Disolver lentamente 52.7 g de K 2 HPO 4 y 30.2 g de KH2PO4 en 500 ml de agua desionizada y ajustar a ph 7.0 ± 0.1 con hidróxido de sodio 1 M o Ácido clorhídrico 1M según corresponda. Enrasar en matraz aforado de 1 L con agua. Duración mínima 3 meses y debe conservarse a una temperatura de entre 2-8 ºC.

5 PRT Página 5 de Preparación de Estándares a) Solución stock Atrazina (1000 ppm): pesar en una navecilla de vidrio aproximadamente 25 mg del estándar de atrazina, en una balanza analítica (precisión g), arrastrar y disolver con pequeño volumen de acetona a un matraz de aforo de 25 ml, aforar hasta completar el volumen. Esta solución debe ser congelada a una temperatura menor o igual a 0 C en viales ámbar b) Solución stock Clorpirifos (1000 ppm): pesar en una navecilla de vidrio aproximadamente 25 mg del estándar de clorpirifos, en una balanza analítica (precisión g), arrastrar y disolver con pequeño volumen de acetona en un matraz de aforo de 25 ml, aforar hasta completar el volumen. Esta solución debe ser congelada a una en viales ámbar. c) Solución stock Cyflutrin (1000 ppm): pesar en una navecilla de vidrio aproximadamente 25 mg del estándar de cyflutrin, en una balanza analítica (precisión g), arrastrar y disolver con pequeño volumen de acetona en un matraz de aforo de 25 ml, aforar hasta completar el volumen. Esta solución debe ser congelada a una temperatura menor o igual a 0 C en viales ámbar. d) Solución stock Difenoconazole (1000 ppm): pesar en una navecilla de vidrio aproximadamente 25 mg del estándar de difenoconazole, en una balanza analítica (precisión g), arrastrar y disolver con pequeño volumen de acetona en un matraz de aforo de 25 ml, aforar hasta completar el volumen. Esta solución debe ser congelada a una en viales ámbar. e) Solución stock Ethion (1000 ppm): pesar en una navecilla de vidrio aproximadamente 25 mg del estándar de ethion, en una balanza analítica (precisión g), arrastrar y disolver con pequeño volumen de acetona en un matraz de aforo de 25 ml, aforar hasta completar el volumen. Esta solución debe ser congelada a una temperatura menor o igual a 0 C en viales ámbar. f) Solución stock Fenvalerato (1000 ppm): pesar en una navecilla de vidrio aproximadamente 25 mg del estándar de fenvalerato, en una balanza analítica (precisión g), arrastrar y disolver con pequeño volumen de acetona en un matraz de aforo de 25 ml, aforar hasta completar el volumen. Esta solución debe ser congelada a una en viales ámbar.

6 PRT Página 6 de 19 g) Solución stock Isoprothiolane (1000 ppm): pesar en una navecilla de vidrio aproximadamente 25 mg del estándar de isoprothiolane, en una balanza analítica (precisión g), arrastrar y disolver con pequeño volumen de acetona en un matraz de aforo de 25 ml, aforar hasta completar el volumen. Esta solución debe ser congelada a una en viales ámbar. h) Solución stock Methidathion (1000 ppm): pesar en una navecilla de vidrio aproximadamente 25 mg del estándar de methidathion, en una balanza analítica (precisión g), arrastrar y disolver con pequeño volumen de acetona en un matraz de aforo de 25 ml, aforar hasta completar el volumen. Esta solución debe ser congelada a una en viales ámbar. i) Solución stock Permetrina (1000 ppm): pesar en una navecilla de vidrio aproximadamente 25 mg del estándar de permetrina, en una balanza analítica (precisión g), arrastrar y disolver con pequeño volumen de acetona en un matraz de aforo de 25 ml, aforar hasta completar el volumen. Esta solución debe ser congelada a una en viales ámbar. j) Solución stock Pirimifos-Metil (1000 ppm): pesar en una navecilla de vidrio aproximadamente 25 mg del estándar de pirimifos-metil, en una balanza analítica (precisión g), arrastrar y disolver con pequeño volumen de acetona en un matraz de aforo de 25 ml, aforar hasta completar el volumen. Esta solución debe ser congelada a una en viales ámbar. k) Solución stock Pyrimethanil (1000 ppm): pesar en una navecilla de vidrio aproximadamente 25 mg del estándar de pyrimethanil, en una balanza analítica (precisión g), arrastrar y disolver con pequeño volumen de acetona en un matraz de aforo de 25 ml, aforar hasta completar el volumen. Esta solución debe ser congelada a una en viales ámbar. l) Solución stock Simazina (1000 ppm): pesar en una navecilla de vidrio aproximadamente 25 mg del estándar de simazina, en una balanza analítica (precisión g), arrastrar y disolver con pequeño volumen de acetona en un matraz de aforo de 25 ml, aforar hasta completar el volumen. Esta solución debe ser congelada a una temperatura menor o igual a 0 C en viales ámbar.

7 PRT Página 7 de 19 m) Solución stock Terbacil (1000 ppm): pesar en una navecilla de vidrio aproximadamente 25 mg del estándar de terbacil, en una balanza analítica (precisión g), arrastrar y disolver con pequeño volumen de acetona en un matraz de aforo de 25 ml, aforar hasta completar el volumen. Esta solución debe ser congelada a una temperatura menor o igual a 0 C en viales ámbar. n) Solución stock Tetraconazole (1000 ppm): pesar en una navecilla de vidrio aproximadamente 25 mg del estándar de tetraconazole, en una balanza analítica (precisión g), arrastrar y disolver con pequeño volumen de acetona en un matraz de aforo de 25 ml, aforar hasta completar el volumen. Esta solución debe ser congelada a una en viales ámbar. o) Solución stock Triadimenol (1000 ppm): pesar en una navecilla de vidrio aproximadamente 25 mg del estándar de triadimenol, en una balanza analítica (precisión g), arrastrar y disolver con pequeño volumen de acetona en un matraz de aforo de 25 ml, aforar hasta completar el volumen. Esta solución debe ser congelada a una en viales ámbar. p) Solución stock Triazophos (1000 ppm): pesar en una navecilla de vidrio aproximadamente 25 mg del estándar de triazophos, en una balanza analítica (precisión g), arrastrar y disolver con pequeño volumen de acetona en un matraz de aforo de 25 ml, aforar hasta completar el volumen. Esta solución debe ser congelada a una en viales ámbar. q) Solución intermedia Atrazina (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µl del estándar de 1000 ppm de Atrazina y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 ml, enrasar hasta r) Solución intermedia Clorpirifos (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µl del estándar de 1000 ppm de Clorpirifos y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 ml, enrasar hasta

8 PRT Página 8 de 19 s) Solución intermedia Cyfluthrin (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µl del estándar de 1000 ppm de Cyfluthrin y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 ml, enrasar hasta t) Solución intermedia Difeconazole (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µl del estándar de 1000 ppm de Difeconazole y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 ml, enrasar hasta completar el volumen con acetona Esta solución debe ser congelada a una u) Solución intermedia Ethion (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µl del estándar de 1000 ppm de Ethion y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 ml, enrasar hasta v) Solución intermedia Fenvalerato (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µl del estándar de 1000 ppm de Fenvalerato y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 ml, enrasar hasta completar el volumen con acetona. Esta solución debe ser congelada a una w) Solución intermedia Isoprothiolane (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µl del estándar de 1000 ppm de Isoprothiolane y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 ml, enrasar hasta completar el volumen con acetona Esta solución debe ser congelada a una x) Solución intermedia Methidathion (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µl del estándar de 1000 ppm de Methidathion y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 ml, enrasar hasta completar el volumen con acetona. Esta solución debe ser congelada a una

9 PRT Página 9 de 19 y) Solución intermedia Permetrina (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µl del estándar de 1000 ppm de Permetrina y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 ml, enrasar hasta z) Solución intermedia Pirimifos- Metil (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µl del estándar de 1000 ppm de Pirimifos- Metil y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 ml, enrasar hasta completar el volumen con acetona. Esta solución debe ser congelada a una aa) Solución intermedia Pyrimethanil (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µl del estándar de 1000 ppm de Pyrimethanil y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 ml, enrasar hasta completar el volumen con acetona Esta solución debe ser congelada a una bb) Solución intermedia Atrazina (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µl del estándar de 1000 ppm de atrazina y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 ml, enrasar hasta cc) Solución intermedia Clorpirifos (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µl del estándar de 1000 ppm de clorpirifos y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 ml, enrasar hasta dd) Solución intermedia Cyfluthrin (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µl del estándar de 1000 ppm de cyfluthrin y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 ml, enrasar hasta ee) Solución intermedia Difeconazole (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µl del estándar de 1000 ppm de difeconazole y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 ml, enrasar hasta completar el volumen con acetona Esta solución debe ser congelada a una ff) Solución intermedia Ethion (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µl del estándar de 1000 ppm de ethion y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 ml, enrasar hasta

10 PRT Página 10 de 19 gg) Solución intermedia Fenvalerato (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µl del estándar de 1000 ppm de fenvalerato y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 ml, enrasar hasta hh) Solución intermedia Isoprothiolane (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µl del estándar de 1000 ppm de isoprothiolane y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 ml, enrasar hasta completar el volumen con acetona Esta solución debe ser congelada a una ii) Solución intermedia Methidathion (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µl del estándar de 1000 ppm de methidathion y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 ml, enrasar hasta completar el volumen con acetona. Esta solución debe ser congelada a una jj) Solución intermedia Permetrina (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µl del estándar de 1000 ppm de permetrina y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 ml, enrasar hasta kk) Solución intermedia Pirimifos- Metil (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µl del estándar de 1000 ppm de pirimifos- metil y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 ml, enrasar hasta completar el volumen con acetona. Esta solución debe ser congelada a una ll) Solución intermedia Pyrimethanil (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µl del estándar de 1000 ppm de pyrimethanil y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 ml, enrasar hasta completar el volumen con acetona Esta solución debe ser congelada a una mm) Solución intermedia Simazina (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µl del estándar de 1000 ppm de simazina y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 ml, enrasar hasta completar el volumen con acetona. Esta solución debe ser congelada a una

11 PRT Página 11 de 19 nn) Solución intermedia Terbacil (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µl del estándar de 1000 ppm de terbacil y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 ml, enrasar hasta oo) Solución intermedia Tetraconazole (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µl del estándar de 1000 ppm de tetraconazole y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 ml, enrasar hasta completar el volumen con acetona. Esta solución debe ser congelada a una pp) Solución intermedia Triadimenol (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µl del estándar de 1000 ppm de triadimenol y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 ml, enrasar hasta completar el volumen con acetona. Esta solución debe ser congelada a una qq) Solución intermedia Triazophos (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µl del estándar de 1000 ppm de triazophos y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 ml, enrasar hasta rr) Solución multiestándar (1 ppm): Tomar una alícuota de 500 µl de cada uno de los estándares de 100 ppm mencionados anteriormente, agregarlo sobre un matraz de aforo de 50 ml, enrasar hasta completar el volumen con acetona. Esta solución debe ser refrigerada a una temperatura entre 2 a 8ºC. ss) Solución multiestándar (0.5 ppm): Tomar una alícuota de 5 ml de la solución multiestándar de 1 ppm, agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 ml y enrasar hasta completar el volumen con acetona. Esta solución debe ser refrigerada a una temperatura entre 2 a 8 ºC. NOTA: La caducidad de cada una de estas soluciones esta indicada en el libro: Preparación de soluciones estándares RGG y mezclas de estándares RGG

12 PRT Página 12 de Preparación de curva de calibración y fortificados a) Curva de calibración (0,04-0,8 µg*ml -1 ): Se preparan cinco niveles para una curva de calibración a partir de la solución multiestándar intermedia de 1,0 ppm. Se toma la alícuota correspondiente de la solución multiestándar, se trasvasija a un vial de 1 ml y se completa el volumen con la solución acetona, siguiendo el esquema de dilución: Solución multiestándar (µg/ml) Alícuota a tomar µl acetona Concentración (µg / ml) , , , , ,8 b) Fortificados (0,2 µg*g -1 ): Para obtener una concentración de los analitos en estudio en la matriz, se procede a agregar una alícuota del multiestándar sobre esta, luego se procede a realizar la extracción como una muestra problema. Los fortificados se obtienen siguiendo el esquema: Solución multiestándar (µg / ml) Alícuota a tomar ml Cantidad de matriz (g) Concentración en matriz (µg / g) 0, , PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Extracción Desde su recepción, las muestras se mantendrán entre 2 ºC a 8 ºC, hasta la preparación para el análisis. Los cereales recibidos se mantienen sin lavar donde se procede a homogenizar en blender una porción representativa y suficiente para realizar una serie de trabajo. El resto de la

13 PRT Página 13 de 19 muestra homogeneizada, se congelará a una debidamente identificada. a) Pesar 20 g de la muestra previamente molida en homogenizador. En este punto debe agregarse la alícuota de los analitos en el caso de muestras fortificadas, y esperar 30 minutos previo a la extracción. b) Adicionar 50 ml de acetonitrilo al homogenizador que contiene la muestra. c) Homogenizar la muestra contenida en blender por 3 minutos a 2500 rpm. d) Vaciar el contenido al sistema de filtración (embudo Buchner, papel filtro Nº 5 A y Kitasato). Se lava el blender con 2 porciones de 15 ml repitiendo los punto d y e. e) Filtrar a través de un embudo de vidrio que posee papel filtro Nº 5A y depositarlo en matraz de aforo de 100 ml, enrasar con acetonitrilo (Solución A). f) Tomar 20 ml de solución A y depositar en embudo de decantación de 125 ml. g) Agregar al embudo de decantación de 125 ml que posee solución A, 8.5 g de NaCl y 20 ml de Tampón fosfato (ph=7,0). h) Agitar 10 minutos en agitador automático de embudos de decantación. i) Dejar reposar hasta separación de fases. j) Desechar la fase acuosa (inferior) en vaso precipitado, y recibir la fase orgánica en matraz erlenmayer de 125 ml k) Adicionar 5 g de sulfato de sodio anhidro a matraz erlenmeyer y agitar manualmente por 15 segundos. l) Pasar el filtrado a través de un embudo de vidrio que posee papel filtro Nº 5 A y depositar en balón de evaporación fondo redondo de 100 ml m) Concentrar el extracto orgánico en Rotavapor con baño termorregulado a 40 ºC o inferior a 1 ml aproximadamente. n) Secar bajo corriente de N 2.

14 PRT Página 14 de 19 o) Reconstituir a 2 ml con mezcla acetona/ hexano (3:7) (Solución B) Purificación a) Instalar en el manifold las columnas SAX/PSA. b) Acondicionar las columnas con 10 ml mezcla acetona/ hexano (3:7). Detener el flujo cuando el menisco alcance el tope del relleno, se debe impedir que las columnas se sequen. Desechar la mezcla acetona/ hexano (3:7). c) Pasar la Solución B a través de las columnas y eluir con 7 ml acetona / hexano (3:7). d) Concentrar el extracto orgánico (Solución B) en rotavapor con baño termorregulado a 40 ºC o inferior a 1 ml aproximadamente. e) Secar bajo corriente de N 2. f) Reconstituir a 1 ml con acetona (Solución Test). g) Leer en GC-MS ANÁLISIS INSTRUMENTAL La determinación de los analitos se realiza a través de GC-MS. Para comprobar el correcto funcionamiento del sistema cromatográfico se debe verificar la respuesta de un patrón directo del nivel mas bajo de la curva de calibración. Además antes de la jornada de uso del equipo, se debe asegurar que el equipo presente las condiciones optimas de trabajo, para eso es necesario realizar una evaluación del sistema interno del equipo (Tune Evaluation), si no se encuentra en condiciones optimas, revisar Instructivo Encendido, operación y apagado del cromatografo gaseosos de gases Nº inventario con detector selectivo de masas HP 5973 MSD Nº inventario IT

15 PRT Página 15 de Condiciones Cromatográficas: DETECTOR GC-MS Columna HP-5MS (0.25mm i.d x 30m x 0.25µm) Temperatura Horno 50 ºC (1 min) 20 ºC / min 125 ºC (0 min) 10 ºC / min 300 ºC (10 min) Temperatura Inyector 250 ºC Temperatura Detector 280ºC (interfase) Modo Inyección Splitlees Gas Portador Helio 5.0 o superior (flujo constante, 1ml/min) Volumen Inyección 1µL Modo Ionización EI Espectrómetro de masas Parámetros de la fuente de iones: Modo: EI Temperatura Cuadrupolo. (ºC): Temperatura Fuente Ionica (ºC) SIM 70 ev

16 PRT Página 16 de Método de Masas Se monitorizan transiciones específicas para cada compuesto a determinar así como tiempos de retención (T.R) aproximados, obtenidos para cada una de ellas. En la cuantificación se utiliza la transición señalada con negrilla en la tabla adjunta para cada compuesto y en la confirmación las transiciones monitorizadas de los compuestos. Transiciones para cada compuesto Nº Analito T.R (min) Iones monitoriados (m/z) 1 Simazina 12, Atrazina 12, Pyrimethanyl 12, Terbacil 13, Pirimifos Metil 14, Chlorpyrifos 14, Tetraconazole 14, Triadimenol 1 15, Triadimenol 2 15, Methidathion Isoprothiolane 16, Ethion 17, Triazophos 17, Permethrin 1 21, Permethrin 2 21, Cyfluthrin 1 21, Cyfluthrin 2 21, Cyfluthrin 3 21, Cyfluthrin 4 21, Fenvalerate 1 23, Fenvalerate 2 23, Difenoconazole 1 23, Difenoconazole 2 24, TRATAMIENTO DE RESULTADOS

17 PRT Página 17 de Cuantificación Se realiza una curva de calibrado correspondiente a 0,04, 0,08, 0,2, 0,4 y 0,8 ppm según se describe en el punto La ecuación de la curva es: y=ax+b Donde: X= Concentración (ppm) del analito según corresponda Y= área del pico del analito según corresponda, para la transición mas abundante o ion cuantificador. Una vez obtenido el valor de interpolación, se procede a determinar la concentración de la muestra definida por la siguiente ecuación: Residuos Pesticidas en Cereales µg/g = [ C x V x ( 100 / 20) ] 10 x 10 W Donde: C= Concentración muestra obtenida en equipo (µg/ml). V= Volumen de muestra (ml). W= Masa muestra (g) Confirmación

18 PRT Página 18 de 19 Siguiendo los criterios de confirmación definidos en Regulación (EC) 657/2002, la identidad del compuesto se considera confirmada cuando: Se observen picos correspondientes a las transiciones características de los analitos a determinar y con una relación señal/ruido igual o superior a 3. La razón resultante de dividir el área del pico correspondiente a la transición menos abundante (ion cualificador) y el área del pico correspondiente a la transición mas abundante (ion cuantificador) debe ser igual al obtenido para las muestras adicionadas. Los ratios para cada uno de los analitos son fijados durante el proceso de validación sobre las muestras fortificadas Expresión de los Resultados Para compuestos con LMR. La expresión de resultados es la siguiente: a) Cuando la concentración obtenida sea inferior al Límite de Cuantificación: Inferior al Límite de Cuantificación (Límite de Decisión (CCα):... ppb, Límite de Cuantificación:...ppb,) b) Cuando la concentración obtenida este comprendida entre el Límite de Cuantificación y el valor superior del rango validado, ambos incluidos, y la identidad ha sido confirmada: Valor numérico en ppb. (Límite de Decisión (CCα):... ppb, Límite de Cuantificación:...ppb Incertidumbre:...%) c) Cuando la concentración obtenida esté por encima del valor superior del rango validado y la identidad ha sido confirmada: Superior a... ppb (valor más alto del rango validado). (Límite de Decisión (CCα):... ppb, Límite de Cuantificación:...ppb) Los valores de CCα y CCβ son obtenidos del análisis de resultados de proceso de validación.

19 PRT Página 19 de Estimación Incertidumbre La incertidumbre del resultado es 2 veces el coeficiente de variación correspondiente a la reproducibilidad (CV) obtenido en la validación según el nivel de concentración ( con un factor de cobertura k=2). Cuando la concentración obtenida se encuentre entre dos niveles, siempre se aplicará el CV menos favorable. I = 2xCV NOTA: Los valores de la Incertidumbre figuran en el Informe de Validación del Método Control de Calidad Se efectuarán controles sistemáticos y periódicos para comprobar la validez de los ensayos realizados con el método analítico recogido en este procedimiento. Los controles de calidad quedan agrupados en tres niveles de control: a) Nivel I: Ensayos de intercomparación, utilización de materiales de referencia certificados y patrones de referencia certificados, según disponibilidad. b) Nivel II: Materiales de referencia sin certificación externa y muestras fortificadas por el analista. c) Nivel III. Este nivel se refiere a los controles a efectuar durante el desarrollo de toda serie de trabajo, por ello será descrito con más detalle e incluye: - Control de blanco (una muestra blanco por cada diez muestras por matriz, según corresponda) - Control muestras adicionadas (una muestra por cada diez muestras por matriz) - Control de respuesta instrumental con un patrón mas bajo de la curva de calibración.