Código: XXXXXX Fecha: 31/12/2008 Versión: 01 Página 1 de 11
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- Andrés Martín Duarte Silva
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1 Código: XXXXXX Versión: 01 Página 1 de OBJETIVO Este método es usado para determinar la concentración de N-methyl carbamatos en suelo, agua y matrices de residuos por Cromatografía Líquida de Alto Desempeño (HPLC) con Derivatización Post-Columna y Detección por Fluorescencia. 2. ALCANCE DE LA APLICACIÓN Este método es usado para determinar la concentración de N-methyl carbamatos en suelo, agua y matrices de residuos. Los compuestos listados en la tabla 1, pueden ser determinados por este método. Tabla 1. Lista de compuestos Nombre del compuesto Número CAS* Nombre del compuesto Número CAS* Aldicarb (temik) Hydroxycarbofuran Aldicarb sulfone Methiocarb (Mesurol) Carbaryl (servin) Methomyl (Lannate) Carbofuran (furadan) Promecarb Dioxicarb Propoxur (Baygon) *Chemical Abstract Registry Number Los límites de detección del método reportados por la referencia se listan en la tabla 2. Tabla 2. Lista de los límites de detección. Nombre del compuesto Tiempo de Limites de detección]* retención µg/l µg/kg Aldicarb sulfone 9,59 1,9 44 Methomyl (Lannate) 9,59 1, Hydroxycarbofuran 12,70 2,6 10 Dioxicarb 13,50 2,2 >50 Aldicarb (temik) 16,05 9,4 12 Propoxur (Baygon) 18,06 2,4 17 Carbofuran (furadan) 18,28 2,0 22 Carbaryl (servin) 19,13 1,7 31 α-naphtol 20, Mehiocarb (mesurol) 22,56 3,1 32 Promecarb 23,02 2,5 17 *Límites de detección reportados por la referencia. Este método esta restringido para uso por analistas experimentados en cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC High Performance Liquid Chromatography) y tener habilidades en la interpretación de cromatogramas.
2 Código: XXXXXX Versión: 01 Página 2 de FUNDAMENTO TEÓRICO Los N-methyl carbamatos son extraídos de muestras acuosas con cloruro de metileno y de muestras de suelo y residuos sólidos oleosos con acetonitrilo. El solvente de extracción es intercambiado a metanol/etilenglicol y luego el extracto es limpiado con cartucho C18, filtrado y eluido en una columna analítica C18. Después de la separación los analitos objetivo son hidrolizados y derivatizados postcolumna y luego cuantificados fluorométricamente. Debido a la naturaleza específica de este análisis no es esencial realizar confirmación por un segundo método. Sin embargo la fluorescencia, debido a la derivatización puede ser confirmada sustituyendo la solución de hidróxido de sodio y o- phtalaldehyde por agua libre de orgánicos y re-analizando la muestra. Si la fluorescencia aún es detectada, una interferencia está presente y se debe tener cuidado en la interpretación de los resultados. La sensibilidad del método usualmente depende en su mayoría del nivel de interferencias que de las condiciones instrumentales. Las muestras de residuos con alto contenido de sustancias fluorescentes extraíbles producirán limites de detección significativamente altos Interferencias Los compuestos fluorescentes, principalmente las alquilaminas las cuales producen alquilaminas primarias basada en hidrólisis, son fuentes potenciales de interferencias. Los compuestos que coeluyen que detienen la fluorescencia pueden generar interferencias negativas. Las impurezas de los solventes y los reactivos son fuentes adicionales de interferencias, por lo tanto antes de procesar las muestras el analista debe demostrar diariamente a través del análisis de los blancos de reactivos que todo el sistema analítico está libre de interferencias. 4. ASPECTOS DE SALUD Y SEGURIDAD LABORAL Manipule con precaución muestras y reactivos, evitando el contacto con piel y ropa. Utilice los elementos de seguridad (bata, guantes, gafas de seguridad, cabina de extracción, máscara para vapores orgánicos) para el manejo de los solventes y materiales de referencia. Mantenga siempre disponible las fichas de seguridad de los reactivos que se manipulan.
3 Código: XXXXXX Versión: 01 Página 3 de EQUIPOS 5.1 Sistema de Cromatografía Líquida de Alto Desempeño (HPLC) Sistema HPLC con capacidad para inyectar 20 µl, desarrollar un gradiente multilineal a flujo constante y debe estar equipado con un sistema para medir las áreas de los picos Columna C18 de fase reversa 25 cm*4,6 mm (5 µm) Reactor post-columna con sistema para liberación de dos solventes. (kratos PCR 520 con 2 sistemas de liberación de solventes Kratos Spectroflow 400 o equivalente) Detector de fluorescencia. (Kratos Spectroflow 980 o equivalente). 5.2 Centrifuga 5.3 Balanza analítica para pesar con una precisión de + 0,0001 g. 5.4 Balanza de carga superior con una precisión de + 0,01 g 5.5 Agitador de plataforma (Shaker) 5.6 Bloque de calentamiento, o equipo similar para acomodar tubos o viales graduados de 10 ml. 6. REACTIVOS Todas las sustancias químicas a ser usadas deben ser grado cromatografía líquida (HPLC). Es necesario que todos los reactivos estén conformes a las especificaciones del Comité de Reactivos Analíticos de la Sociedad Americana de Química. Se pueden usar sustancias de otros grados siempre y cuando el reactivo sea lo suficientemente puro para permitir su uso sin disminuir la precisión de la determinación Acetonitrilo grado HPLC, CH 3 CN (Mínimo corte de longitud de onda UV 203 nm) Metanol grado HPLC, CH 3 OH (Mínimo corte de longitud de onda UV 230 nm) Cloruro de metileno grado HPLC, CH 2 Cl 2 (Mínimo corte de longitud de onda UV 230 nm) Hexano grado análisis de pesticidas C 6 H Etilengliclol grado reactivo, HOCH 2 CH 2 OH Agua libre de orgánicos. (Como se define en el protocolo de control de calidad) Hidróxido de sodio grado reactivo, NaOH, Solución 0,05 N 6.8. Acido fosfórico grado reactivo, H 3 PO Buffer de boratos ph 10 (J.T. Baker #5609-1, o equivalente) o Phthaldehyde, o-c 6 H 4 (CHO) 2 grado reactivo mercapetanol, HSCH 2 CH 2 OH grado reactivo Estándares de N-methyl carbamates (equivalentes a USEPA estándares) Acido cloroacético, ClCH 2 COOH
4 Código: XXXXXX Versión: 01 Página 4 de Solución de reacción: Disuelva 0,500 g de o-phthaldehyde en 10 ml de metanol, en un matraz volumétrico de 1 L. A esta solución añada 900 ml de agua grado reactivo seguido de 50 ml de buffer de boratos ph 10. Después mezcle bien y añada 1 ml de 2-mercaptoetanol. Posteriormente diluya hasta la marca con agua libre de orgánicos. Mezcle la solución. Prepare soluciones frescas semanalmente, proteja de la luz y almacene en refrigeración Soluciones estándar Soluciones Stock estándar: Prepare soluciones individuales de 1000 mg/l añadiendo 0,025 g de carbamatos a un matraz volumétrico de 25 ml y diluya hasta la marca con metanol. Almacene en refrigeración en viales de vidrio con tapa de teflón. Reemplace cada 6 meses Soluciones estándar Intermedios: Prepare una mezcla de carbamatos de 50 mg/l adicionando 2,5 ml de cada solución stock en un matraz volumétrico de 50 ml y diluya hasta la marca con metanol. Almacene las soluciones en refrigeración en viales de vidrio con tapa de recubrimiento de teflón o grafables Soluciones estándar de trabajo: Prepare soluciones de 0,5 1,0 2,0 3,0 y 5,0 mg/l adicionando 0,25 0,5 1,0 1,5 y 2,5 ml de la solución intermedia en un matraz de 25 ml, respectivamente, y diluya hasta la marca con metanol. Almacene las soluciones bajo refrigeración en viales de vidrio con tapa de teflón. Reemplace estas soluciones cada 2 meses o antes si es necesario Solución estándar mixto de control de calidad: Prepare una solución de 40 mg/l de otro grupo de stocks preparada similarmente al grupo de stocks. Añada 2 ml de cada stock en un matraz volumétrico de 50 ml y diluya hasta la marca con metanol. Almacene la solución bajo condiciones de refrigeración en viales con tapa de recubrimiento teflón o grafables. Reemplace cada 3 meses. 7. MATERIALES E INSUMOS 7.1. Jeringa de HPLC de 50 µl Papel filtro (Whatman 113 y 114 o equivalente) Pipetas volumétricas clase A de diferentes tamaños Cartucho de fase reversa C18 (C-18 Sep-Pak (Water Associates) o equivalente) Jeringas de vidrio de 5 ml Matraces volumétricos clase A de diferentes volúmenes Matraces Erlenmeyer con tapa de teflón de 250 ml Embudos de vidrio Embudos de separación con tapa de vidrio y llave de teflón de 250 ml Probetas graduadas de 100 ml Viales de vidrio graduados de 10 ml, 20 ml Tubos de centrifuga de 250 ml o de 50 ml, según el tamaño de la centrifuga.
5 Código: XXXXXX Versión: 01 Página 5 de Viales de 25 ml con tapa rosca con recubrimiento de teflón o con grafas Micropipeta de desplazamiento positivo de capacidad de 3 a 25 µl (Gilson Microman o equivalente) 7.15 Filtros nylon de 25 mm de diámetro, 0,45 µm de tamaño de poro desechables (Alltech Associates # 2047 o equivalente). 8. CONSIDERACIONES PARA LA TOMA DE MUESTRA 8.1. Debido a la extrema inestabilidad de los N-methylcarbamatos en medio alcalino, acuoso, residuo acuoso o lixiviado, se debe preservar inmediatamente después de la recolección acidificando a ph 4 5 con 0,1 N ácido cloroacético Almacene las muestras a 4 C y lejos de la luz solar directa a partir del momento de la toma de la muestra hasta el análisis. Los N-methylcarbamatos son sensibles a la hidrólisis alcalina y al calor Todas las muestras deben ser extraídas dentro de los 7 días después de la toma de la muestra y analizadas dentro de los 40 días de la extracción. 9. LIMPIEZA DE MATERIAL Ver protocolo de Toma y Preservación de Muestras y Limpieza de Material para Determinación de Plaguicidas 10. PREPARACIÓN DE MUESTRAS Extracción Aplicable a Aguas Residuales Domesticas, Residuos Industriales Acuosos y Lixiviados a. Medir 100 ml de la muestra en un embudo de separación de 250 ml y extraer por agitación vigorosa por 2 minutos con 30 ml de de cloruro de metileno, repetir la extracción 2 o más veces. b. Combine todos los extractos en un matraz volumétrico de 100 ml y diluya a volumen con cloruro de metileno. c. Continúe con el paso de limpieza si es necesario, si no continúe con el intercambio de solvente Extracción Aplicable a Suelos, Sólidos, Lodos y Suspensiones Acuosas Pesadas a. Determinación del porcentaje seco de la muestra: en algunos casos es deseable reportar el resultado en base seca, cuando esto es deseado se debe tomar una
6 Código: XXXXXX Versión: 01 Página 6 de 11 porción de muestra que debe ser pesada al mismo tiempo que la porción usada para la determinación analítica. Advertencia: El horno de secado debe estar contenido en una cabina de extracción o venteo, para evitar contaminación en el área de laboratorio. Inmediatamente después de pesar la muestra para extracción pese 5 a 10 g de la muestra en un crisol previamente tarado, determine el contenido de peso seco de la muestra por secado durante la noche a 105 C, permita enfriar el crisol en desecador antes de pesar: % de peso seco = gramos de muestra seca *100/ gramos de muestra. b. Inicie la extracción pesando ,1 g de la muestra en un erlenmeyer de 250 ml con tapa de teflón. c. Añada 50 ml de acetonitrilo y agite por 2 horas en plataforma de agitación (shaker). d. Permita que la mezcla se sedimente 5 a 10 minutos. e. Decante el extracto en tubos de centrifuga de 250 ml. f. Repita dos veces más la extracción con 20 ml de acetonitrilo y una hora de tiempo de extracción en plataforma de agitación (shaker). g. Decante y combine todos los extractos. h. Centrifugue el extracto a 200 rpm por 10 minutos. i. Cuidadosamente decante el sobrenadante en un matraz volumétrico de 100 ml y diluya a volumen con acetonitrilo. (Factor de dilución 5). j. Proceda al paso de intercambio de solvente Extracción Aplicable a Suelos Altamente Contaminados con Sustancias No Acuosas como Aceites. a. Determinación del porcentaje seco de la muestra: En algunos casos es deseable reportar el resultado en base seca, cuando esto es deseado se debe tomar una porción de muestra que debe ser pesada al mismo tiempo que la porción usada para la determinación analítica. Advertencia: El horno de secado debe estar contenido en una cabina de extracción o venteo, para evitar contaminación en el área de laboratorio. Inmediatamente después de pesar la muestra para extracción pese 5 a 10 g de la muestra en un crisol previamente tarado, determine el contenido de peso seco de
7 Código: XXXXXX Versión: 01 Página 7 de 11 la muestra por secado durante la noche a 105 C, permita enfriar el crisol en desecador antes de pesar: % de peso seco = gramos de muestra seca *100/ gramos de muestra. b. Inicie la extracción pesando ,1 g de la muestra en un erlenmeyer de 250 ml con tapa de teflón. c. Añada 60 ml de hexano y agite por 1 hora en plataforma de agitación (shaker). d. Añada 50 ml de acetonitrilo y agite por 3 horas en plataforma de agitación (shaker). e. Permita que la mezcla se sedimente 5 a 10 minutos. f. Decante las capas de solvente en un embudo de separación de 250 ml. g. Drene la capa inferior de acetonitrilo a través de papel filtro en un matraz de 100 ml. h. Añada 60 ml de hexano y 50 ml de acetonitrilo a la muestra en el matraz de extracción y agite por 1 horas en plataforma de agitación (shaker). i. Permita que la mezcla se sedimente 5 a 10 minutos. j. Decante las capas de solvente en un embudo de separación conteniendo el hexano de la primera extracción. k. Agite el embudo de separación por 2 minutos, permita que las fases se separen. l. Drene el acetonitrilo a través de papel filtro en un matraz volumétrico de 100 ml y diluya a volumen con acetonitrilo. (Factor de dilución 5). m. Proceda al paso de intercambio de solvente Extracción Aplicable a Líquidos No Acuosos tales como Aceites a. Inicie la extracción pesando ,1 g de la muestra en un erlenmeyer de 250 ml, transfiera a un embudo de separación de 125 ml. b. Añada 40 ml de hexano y 25 ml de acetonitrilo y agite vigorosamente por 2 minutos. c. Permita que las fases se separen. d. Drene la capa inferior de acetonitrilo a través de papel filtro en un matraz de 100 ml. e. Añada 25 ml de acetonitrilo al embudo de separación y agite vigorosamente por 2 minutos. f. Permita que las fases se separen. g. Drene la capa inferior de acetonitrilo a través de papel filtro en un matraz de 100 ml. h. Repita la extracción con otros 25 ml de acetonitrilo al embudo de separación y agite vigorosamente por 2 minutos. i. Permita que las fases se separen. j. Drene el acetonitrilo a través de papel filtro en un matraz volumétrico de 100 ml y diluya a volumen con acetonitrilo. (Factor de dilución 5). k. Proceda al paso de intercambio de solvente.
8 Código: XXXXXX Versión: 01 Página 8 de Limpieza a. Tome 20 ml del extracto en un tubo o vial conteniendo 100 µl de etilenglicol. Lleve el vial a un bloque de calentamiento a 50 C y evapore el extracto bajo una corriente de nitrógeno (en una cabina de extracción) únicamente el etilenglicol debe permanecer. b. Disuelva el residuo de etilenglicol en 2 ml de metanol. c. Pase el extracto a través de un cartucho de fase reversa C18 prehumedecido y colecte el eluato en un tubo de 5 ml. d. Eluya el cartucho con metanol hasta que un volumen final de 5 ml sea obtenido. (Factor de dilución 0,25). e. Usando un filtro de desechable de 0,45 µm, filtre una alícuota del extracto limpio directamente en un vial apropiado. El extracto esta listo para análisis, proceda con el paso de determinación Intercambio de Solvente Intercambio de Solvente Aplicables a los Extractos de Muestras de Agua, Agua Residual Domestica, Residuos Industriales Acuosos y Lixiviados a. Tome 10 ml del extracto en un vial o tubo de 10 ml que contiene 100 µl de etilenglicol. b. Lleve el vial a un bloque de calentamiento a 50 C y evapore suavemente bajo una corriente de nitrógeno (en una cámara de extracción) hasta que solo permanezca el etilenglicol. c. Añada metanol gota a gota hasta completar un volumen total de 1 ml (dilución 0,1). d. Usando filtro de desechables de 0,45 µm filtre el extracto y llévelo a un vial y esta listo para análisis. e. Proceda con el paso de determinación Intercambio de Solvente Aplicables a los Extractos de Muestras de Suelos, Sólidos, Lodos, Suspensiones Altamente Acuosas y Líquidos No Acuosos a. Eluya 15 ml del extracto de acetonitrilo a través de un cartucho de fase reversa C18, prelavado con 5 ml de acetonitrilo. b. Descarte los 2 primeros ml de eluato y colecte el remanente. c. Tome 10 ml del eluato en un tubo conteniendo 100 µl de etilenglicol. d. Lleve el tubo a un bloque de calentamiento a 50 C y evapore el extracto lentamente bajo una corriente de nitrógeno (en una cabina de extracción) hasta que permanezca solo el etilenglicol. e. Añada metanol gota a gota hasta completar un volumen total de 1 ml (dilución 0,1).
9 Código: XXXXXX Versión: 01 Página 9 de 11 f. Usando filtro de desechable de 0,45 µm, filtre el extracto llévelo a un vial y esta listo para análisis. g. Proceda con el paso de determinación. 11. PROCEDIMIENTO ANALÍTICO Analice las muestras de acuerdo con las condiciones cromatográficas dadas a continuación: Condiciones Cromatográficas Solvente A: Agua libre de orgánicos acidificada con 0,4 ml de ácido fosfórico por litro de agua. Solvente B: Metanol/Acetonitrilo (1:1, v/v) Flujo: 1 ml/min Volumen de inyección: 20 µl Programación de liberación de solvente Tiempo ( min) Función Valor Duración Archivo 0 FR %B 10% 0 0,02 %B 80% ,02 %B 100% ,02 %B 100% ,02 %B 10% ,02 %B 10% ,02 ALARMA 0, Parámetros de Hidrólisis Post-Columna Solución: Hidróxido de sodio acuoso 0,05 N Flujo: 0,7 ml/min Temperatura: 95 C Tiempo de residencia: 35 segundos (reactor de 1 ml) Parámetros de Derivatización Post-Columna Solución: o-phthalaldehyde/2-mercaptoetanol Flujo: 0,7 ml/min Temperatura: 40 C Tiempo de residencia: 25 segundos (coil de 1 ml)
10 Código: XXXXXX Versión: 01 Página 10 de Parámetros del Fluorómetro Celda: 10 µl Longitud de onda de excitación: 340 nm Longitud de onda de emisión: 418 nm corte de filtro Longitud de onda de sensibilidad: 0,5 µa PMT voltaje: -800 V Constante de tiempo: 2 segundos Si las señales de las áreas de los picos de las muestras exceden el rango de calibración del sistema, diluya el extracto como sea necesario y re-analice el extracto diluido CALIBRACIÓN a. Analice un blanco de solvente (20 µl de etanol) para asegurar que el sistema está limpio. b. Analice los estándares de calibración empezando con el de 0,5 mg/l y terminando con el de 5 mg/l. Si la desviación estándar relativa (%DSR) del factor de respuesta (FR) no excede el 20% el sistema esta calibrado y las muestras se puede proceder a analizarlas. Si el %DSR para un analito excede el 20% revise el sistema y re-calibre con soluciones preparadas frescas. c. Usando la calibración establecida con los factores medios de respuesta, chequee la calibración del instrumento al comienzo de cada día usando el estándar mixto de 2 mg/l, si la concentración de cada analito cae en el rango de 1,70 a 2,30 mg/l (dentro del 15% del valor verdadero), el instrumento es considerado calibrado y se puede proceder al análisis de las muestras. Si el valor esta fuera del rango el instrumento debe ser recalibrado. d. Después de cada 10 muestras analizadas o menos, se debe analizar el estándar de 2 mg/l para asegurar que los tiempos de retención y factores de respuesta están dentro de los límites aceptables. 12. METODOLOGÍA DE CÁLCULO Cálculos del Factor de Respuesta, RF Calcule cada factor de respuesta así: RF = Concentración del estándar / área de la señal Media RF = (Sumatoria RF i )/ 5 % RSD de Media RF = {[(Sumatoria RF i RF media) 2 ] 1/2 / 4} *100 / RF media
11 Código: XXXXXX Versión: 01 Página 11 de Cálculo de la Concentración µg/g ó mg/l = RF media * área de la señal * factor de dilución 13. ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD ANALÍTICA Antes de procesar las muestras el analista debe demostrar a través del análisis del blanco para cada tipo de matriz que toda la vidriería y reactivos están libres de interferencias. Cada vez que halla un cambio de reactivos el blanco debe ser procesado para verificar su adecuado desempeño Se debe preparar y analizar una solución de chequeo con cada grupo de muestras. Prepare esta solución de 2 mg/l a partir del estándar mixto de 40 mg/l, el rango de respuesta aceptable es de 1,7 a 2,3 mg/l para cada analito La interferencia negativa que se presenta debido a la limitación de la fluorescencia puede ser determinada por adiciones conocidas y comparadas contra la respuesta esperada Confirme los analitos detectados por sustitución del hidróxido de sodio o- phthaldehyde en el sistema de reacción post-columna con agua desionizada y analizando el extracto sospechoso. La fluorescencia continuada indicará que hay presencia de una interferencia positiva. 14. PROPUESTA DE VALIDACIÓN DEL MÉTODO Aseguramiento de la Calidad y Estandarización de Métodos Cromatográficos. 15. BIBLIOGRAFÍA N-methyl carbamates by High performance liquid chromatography (HPLC). USEPA Method 8318
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