Introducción. Electroforesis zonal Campo aplicado a un soporte estabilizante Muestra dispuesta sobre una zona reducida del soporte
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- Amparo Villalba Alvarado
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1 Introducción Técnica analítica separativa: Transporte de moléculas cargadas bajo la acción de un campo eléctrico Movilidad electroforética depende de: La carga de la molécula Depende del medio ph Fuerza iónica El tamaño de la molécula, incluyendo esfera de solvatación La forma de la molécula Tipos de electroforesis Electroforesis libre Campos aplicados sobre una disolución o suspensión Poca resolución. Poca utilidad Electroforesis zonal Campo aplicado a un soporte estabilizante Muestra dispuesta sobre una zona reducida del soporte Material necesario La muestra, dispuesta en una pequeña zona del soporte lo recorre impulsada por el campo eléctrico Efectos perjudiciales Difusión Calentamiento (efecto Joule) Corrientes de convección
2 Factores que Afectan a la Electroforesis Campo eléctrico. Depende de: Potencial eléctrico, V (en Voltios) Bajo voltaje (normal): V Alto voltaje: 50010,000 V Intensidad, i (en Amperios) Relacionada con V a través de la resistencia R (en ohmios): Ley de Ohm: V = i R Temperatura El paso de corriente produce calor (efecto Joule) Soporte Adsorción inespecífica (efecto negativo) Tamizado molecular, en geles de poliacrilamida Factores de la disolución Electroforesis hidrólisis en electrodos producción de H+ y OH Es necesario un tampón Tampón continuo o discontinuo La fuerza iónica Influye en la esfera de solvatación Afecta a la conductividad El ph Determina la carga de las moléculas FUNDAMENTAL Moléculas de la muestra Carga, Tamaño El Soporte Compatible con el disolvente Inerte al proceso de migración No cargado No adsorbente Tipos de soporte No restrictivos No impiden el paso de las moléculas Agarosa Papel: poco utilizado Acetato de celulosa: Grosor y tamaño de poro controlado Transparente por deshidratación Utilidad: Análisis clínico de suero, orina, etc. Restrictivos Geles de poliacrilamida El tamaño del poro impone resistencia al paso de las moléculas Distinta migración según su tamaño Minimiza problemas de difusión y convección Electroforesis en Acetato de Celulosa Útil para proteínas Poli electrolitos La carga depende: Del punto isoeléctrico de la proteína Depende del contenido en aminoácidos protonables Ácidos (Glu, Asp) Básicos (Arg, Lys, His)
3 Del ph del medio Tamaño mucho menor que los poros del soporte Separación depende sólo de la densidad de carga Relación carga/masa al ph considerado Aplicación de las muestras Marcador electroforético Molécula coloreada de mucha carga y pequeño tamaño. Permite observar el frente de avance Dinitrofenillisina (DNPLys) Azul de bromofenol Tratamiento postelectroforesis Fijación: precipitación (TCA, ácido acético o metanol) Tinción con colorante Negro amido Azul coomassie Rojo Ponceau Decoloración Análisis Densitometrado Obtención del Suero
4 Electroforesis de suero en acetato de celulosa Electroforesis en Geles de Poliacrilamida (PAGE) Minimiza difusión y convección Separación por carga y por tamaño Soporte inerte, transparente y estable Fácil de preparar con tamaños de poro variados Preparación del soporte: Polimerización de acrilamida entrelazando con bisacrilamida Control del reticulado a través del % de monómeros Geles homogeneos Una única concentración de acrilamida Geles en gradiente Concentración de acrilamida variable Mayor resolución Sistemas de tampón discontinuo Efecto de concentración de la muestra (mayor resolución) Tinción Azul coomassie (0,10,5 g por banda) Sales de plata (hasta 0,1 ng por banda) Preparación de Geles de Poliacrilamida
5 Sistema de Electroforesis para Geles de Poliacrilamida Condiciones Desnaturalizantes En presencia de SDS Complejos SDSproteína. Se separan sólo según su tamaño molecular En presencia de agentes reductores (DTT o mercaptoetanol) Rotura de puentes disulfuro intra e intermoleculares Observación de cadenas monoméricas Estimación de masas moleculares
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