FUNDAMENTOS. ELECTROFORESIS/ Versión 3.0/ MÓDULO 3/ CÁTEDRA DE FÍSICA/ FFYB/ UBA/

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1 FUNDAMENTOS. ELECTROFORESIS/ Versión 3.0/ MÓDULO 3/ CÁTEDRA DE FÍSICA/ FFYB/ UBA/

2 La electroforesis es una técnica separativa que se basa en el fenómeno de migración diferencial que experimentan partículas cargadas eléctricamente al estar bajo la influencia de un campo eléctrico. En este módulo se estudian los fundamentos de la electroforesis y se analizan las variables, desde el punto de vista eléctrico, que afectan la distancia que migra una sustancia en una corrida electroforética. Hay distintas variantes dentro de las técnicas electroforéticas. A lo largo de las carreras, en diferentes materias, se ven y utilizan estas diversas técnicas aplicadas a diferentes situaciones y/o con distinto objetivo. Te recomendamos que también consultes la bibliografía de este tema, junto con el seminario que se discutió en la clase. FUNDAMENTO Descripción dinámica del movimiento Una carga eléctrica inmersa en un campo eléctrico experimenta una fuerza de atracción o repulsión, como describe la Ley de Coulomb: (Ec. 1) La carga se desplazará en el medio hacia el polo que posee carga opuesta como consecuencia de la fuerza de atracción eléctrica: las moléculas cargadas positivamente se desplazarán hacia el cátodo (polo negativo) y las cargadas negativamente se desplazarán hacia el ánodo (polo positivo). En un medio donde el campo eléctrico es homogéneo, el módulo de la fuerza eléctrica que actúa sobre la carga depende tanto de la intensidad del campo eléctrico como del valor de la carga en estudio. (Ec. 2) (Ver Teóricos de Electricidad y Campos) Cátedra de Física-FFYB-UBA [2]

3 E + - F e Figura 1: Cargas en un campo eléctrico homogéneo. Las cargas experimentan una fuerza eléctrica con sentido hacia el polo de carga opuesta. : vector campo eléctrico; : vector fuerza eléctrica; + : polo positivo o ánodo; - : polo negativo o cátodo. F e En un primer instante, la fuerza eléctrica imprime en la partícula cargada una aceleración inicial, como resultado la misma comienza a moverse. La segunda ley de Newton describe la relación entre la aceleración y la fuerza: Ec. 3) Cuando la partícula se encuentra inmersa en un fluido (en el caso de la electroforesis, este medio corresponde al buffer de corrida) aparece sobre ella una fuerza de rozamiento, ya que el fluido en el que se mueve la partícula se opone a su movimiento. La fuerza de rozamiento es proporcional a la velocidad de la partícula, tiene igual dirección que la fuerza eléctrica pero sentido opuesto. (Ec. 4) Siendo k, el coeficiente de proporcionalidad o coeficiente de fricción, en el cual están incluidas variables como la viscosidad del medio, el tamaño y la forma de la partícula. La fuerza de rozamiento dependerá entonces de estas tres variables, además de la velocidad de la partícula. Si consideramos una partícula esférica que se mueve en condiciones en las que se cumpla la Ley de Stokes (Ver módulo II: Viscosidad para recordar), la expresión para la fuerza de rozamiento puede escribirse como: (Ec. 5) Siendo η: la viscosidad del medio a la temperatura de trabajo; r y el radio y la velocidad de la partícula respectivamente. Apenas la molécula comienza a moverse en el solvente a causa de la fuerza eléctrica, aparece la fuerza de rozamiento que se opone al movimiento y por lo tanto su aceleración inicial disminuye. Es así que la fuerza neta Cátedra de Física-FFYB-UBA [3]

4 que actúa sobre la partícula será entonces la resultante entre la fuerza eléctrica y la de rozamiento, y resulta igual a la diferencia entre ambas. Esta resultante será la que determinará su migración en el medio de corrida. + Fr Fe E - Figura 2: Fuerzas involucradas en el movimiento de una partícula cargada positivamente cuando está inmersa en un medio donde existe un campo eléctrico. : vector campo eléctrico; : vector fuerza eléctrica; : vector fuerza de rozamiento. Las flechas representan la dirección y sentido de los vectores y en cada caso las longitudes de los vectores fuerza son proporcionales a sus respectivos módulos. Ahora bien, la fuerza de rozamiento no es constante ya que se incrementa a medida que aumenta la velocidad de la partícula (Ec. 4), y consecuentemente disminuye progresivamente la aceleración. Llega un momento en que la fuerza de rozamiento adquiere la misma intensidad que la fuerza eléctrica. Dado que ambas fuerzas tienen igual dirección pero sentidos contrarios, la resultante sobre la partícula será igual a cero. + Fr Fe E - Figura 3: Situación de equilibrio en una partícula cargada positivamente inmersa en un medio donde hay un campo eléctrico uniforme. El módulo de la fuerza eléctrica resulta igual al de la fuerza de rozamiento,, por lo que la sumatoria de fuerzas en el equilibrio es igual a cero. e es la fuerza eléctrica, es la fuerza de rozamiento y, vector campo eléctrico. En consecuencia, a partir de este momento, la partícula no estará afectada por aceleración alguna y se moverá a velocidad constante siendo esta velocidad la máxima que alcanza en el seno del fluido bajo un campo eléctrico uniforme. Dado que esta situación se alcanza a los pocos segundos, se puede asumir que la velocidad es constante durante todo el desplazamiento. (Si te surgen dudas revisá módulo II: Viscosidad - Método de Stokes) Cátedra de Física-FFYB-UBA [4]

5 Variables que determinan la velocidad de movimiento La migración de una partícula en un medio sometido a un campo eléctrico depende de la velocidad que adquiere en él. Pensemos, entonces, qué variables inherentes al sistema afectan a dicha velocidad. Por lo dicho en el apartado anterior, puede considerarse que durante todo el desplazamiento la sumatoria de fuerzas sobre la partícula es igual a cero, por lo tanto, está en equilibrio, (Ec. 6) Reemplazando según la ecuación 2 (dado que el campo eléctrico es homogéneo) y por la ecuación 4, se obtiene: (Ec. 7) En una primera aproximación, se deduce fácilmente de esta ecuación que la velocidad que adquiere una partícula cargada eléctricamente cuando está en un campo eléctrico depende de la partícula - carga, tamaño y forma-, de la viscosidad del medio y la intensidad del campo eléctrico aplicado. Cabe destacar que le movimiento de las partículas también se encuentra condicionado a la difusión natural como también a la temperatura de trabajo. Asimismo, la fuerza iónica y el ph del medio afectan la carga neta de partícula y por lo tanto la velocidad de la misma. La fuerza iónica es una medida de las cargas en una solución, estima la actividad de los electrolitos en solución según su carga y concentración. Una mayor fuerza iónica, da cuenta de una mayor concentración de iones en la solución. (Para más información sobre fuerza iónica consulta: Chang, Química General, McGrawHill Skoog-West, Fundamentos de química analítica, España, McGrawHill). Una partícula con carga cuando se halla en solución está rodeada por electrolitos de carga opuesta, como consecuencia de la acción de la fuerza de atracción electroestática. Es así que, una carga positiva en solución estará rodeada de cargas negativas y una negativa por carga positivas. Esta esfera de cargas en el entorno dependerá a su vez del número y tipo de cargas disueltas en la solución (fuerza iónica). Cátedra de Física-FFYB-UBA [5]

6 En el caso de la electroforesis la presencia de electrolitos en el entorno tiende a contrarrestar la migración de la partícula en estudio, puesto que los contraiones tienden a moverse en sentido opuesto por su carga. Por ello, la velocidad que alcanza la partícula en un medio con muchos electrolitos será inferior a la que alcanzaría en un entorno con un menor número de cargas totales. Se puede pensar como un apantallamiento de la carga neta de la partícula como consecuencia de los contra-iones que la rodean. Figura 4: Efecto de la fuerza iónica sobre la migración de una partícula cargada en solución, bajo la acción de un mismo campo eléctrico. Una mayor fuerza iónica determina una menor velocidad de migración ya que la partícula debe contrarrestar la tendencia a moverse en sentido opuesto que presentan sus contra-iones. En cambio, cuando la concentración de cargas es menor, la partícula tiene mayor libertad para desplazarse en el medio. En el esquema, se indica el vector velocidad en cada caso, siendo la longitud del vector proporcional a su módulo. La flecha inferior indica la dirección y sentido del vector campo eléctrico. El ph influye sobre la carga que adquieren los grupos ácidos y básicos presentes en las moléculas. Las moléculas biológicas suelen presentar grupos con características de ácido o de base débil. Por lo tanto, se ionizan parcialmente en solución coexistiendo en equilibrio distintas especies. Se ejemplifica a continuación su equilibrio de ionización: Figura 5: Equilibrio de ionización en agua de ácidos y bases débiles. El grado de ionización de los distintos grupos funcionales está en relación con el ph del medio en que se encuentran, puesto que las especies H 3 O + y OH - forman parte de la situación de equilibrio. Por lo tanto, de acuerdo con las Cátedra de Física-FFYB-UBA [6]

7 condiciones de ph, cada grupo con características de ácido o base débil presente en la molécula se encontrará ionizado en menor o mayor proporción. Existen situaciones extremas donde el equilibrio se haya totalmente desplazado en un sentido, por ejemplo: bajo condiciones de ph muy altas (baja concentración de H 3 O + ) los ácidos débiles se consideran totalmente ionizados, por lo que el grupo funcional siempre presentará carga eléctrica. Lo mismo ocurre con las bases a valores de ph muy bajos. En otras situaciones de equilibrio coexistirán en la solución especies de la misma molécula con distinta carga, consecuencia del valor de ph del medio en el que se encuentra. (Para ampliar este tema revisa el ANEXO de este módulo) La temperatura afecta la velocidad con la que se desplaza la partícula por incidir en tres instancias específicas. En primer lugar, hay que considerar que la viscosidad del buffer es una constante física que depende de la temperatura, por ende el coeficiente de fricción variará según cuál sea el valor de la viscosidad del medio a la temperatura de trabajo. En segundo lugar, la energía cinética intrínseca de las moléculas, que determina el fenómeno de difusión, está en directa relación con la temperatura. Por último, dadas ciertas condiciones de temperatura se ve afectada la evaporación del buffer lo cual altera su fuerza iónica. Por lo tanto bajo iguales condiciones de corrida (igual buffer de corrida -fuerza iónica, ph y viscosidad-, igual campo eléctrico, igual temperatura), partículas que difieran en carga, tamaño y/o forma migrarán a distinta velocidad, y por ende recorrerán distinta distancia durante un mismo período de tiempo. Este es el fenómeno físico en que se fundamenta la técnica separativa denominada electroforesis. Ahora bien, como se puede concluir de la Ec. 7 la velocidad de la partícula también depende del campo eléctrico aplicado, por lo que sería útil independizarnos del mismo si queremos comparar distintas sustancias entre sí. Para ello utilizaremos el concepto de movilidad electroforética en lugar de la velocidad de la partícula. Movilidad electroforética (µ) La movilidad electroforética de una molécula cargada que se mueve en un campo eléctrico, se define como el cociente entre la velocidad de la misma y el campo eléctrico aplicado. Es decir, es la velocidad que adquiere la partícula por unidad de campo eléctrico aplicado. (Ec. 8) Cátedra de Física-FFYB-UBA [7]

8 En el equilibrio, se cumple la ecuación 7 y por lo tanto, la movilidad puede escribirse como: (Ec. 9) La ecuación 9 pone de manifiesto que la movilidad electroforética depende de la carga de la partícula y del coeficiente de fricción. Como ya vimos, éste depende de la forma y el tamaño de la partícula, así como de la viscosidad del medio. En cuanto a la carga, es una característica inherente a la molécula pero que se encuentra afectada por la fuerza iónica y el ph de buffer en que se realiza la corrida. Dada la Ec.7 ya se estableció que la velocidad adquirida también depende de la intensidad del campo eléctrico aplicado, por ello vale destacar que en las ecuaciones anteriores (8 y 9), velocidad y campo eléctrico son variables interrelacionadas. Es decir, si aumenta aumenta, siendo constante la movilidad (µ) de la sustancia en el sistema en estudio. Es decir, la movilidad NO depende del campo eléctrico aplicado. En conclusión, podemos decir que la movilidad es una constante física para una sustancia si se mantienen constantes el medio (ph, fuerza iónica, viscosidad) y la temperatura. Por lo tanto está en íntima relación con las condiciones de trabajo seleccionadas. Es así que en condiciones dadas puede utilizarse como criterio de identificación. DETERMINACIÓN DE LA MOVILIDAD ELECTROFORÉTICA Expresión de la movilidad en términos de variables controlables en la corrida La movilidad electroforética depende de los parámetros ya mencionados (características de la partícula y del medio en que está inmersa) pero su cálculo puede hacerse también en relación a las variables experimentales que se controlan durante la corrida en el equipo electroforético. Cátedra de Física-FFYB-UBA [8]

9 Analicemos el esquema de una corrida electroforética en la que se utiliza la técnica de electroforesis de zona, es decir la realizada sobre un soporte de papel, acetato de celulosa, geles de diferente composición, polímeros de acrilamida, etc. Al final de la corrida se observa que la especie química en estudio se desplazó una distancia, d, durante un tiempo t, en un soporte electroforético de longitud L, entre cuyos extremos (a y b) se aplicó una diferencia de potencial, ΔVab. Ánodo Cátodo Figura 6: Ejemplo de una corrida electroforética de una sustancia. Se muestra una tira de papel soporte-, donde se estableció una diferencia de potencial entre los puntos a y b (ΔVab), Vector campo eléctrico, L: longitud del soporte, d: distancia corrida por la muestra. Se indican los polos y la línea en la que la muestra fue sembrada. Vimos que la movilidad es la constante de proporcionalidad que relaciona la velocidad de una partícula con el campo eléctrico aplicado: (Ec. 8) Dado que: (Ec. 10) donde: d = distancia recorrida por la partícula y t = tiempo de corrida y que en un campo homogéneo: (Ec.12.a) Como en el caso de la electroforesis puede considerarse el campo eléctrico homogéneo en la longitud del soporte (L): Donde V es el voltaje dado por la fuente de poder. (Ec. 11.b) Podemos escribir entonces, la movilidad electroforética en términos de las variables experimentales, utilizando las ecuaciones 11 y 12, como: Cátedra de Física-FFYB-UBA [9]

10 (Ec. 12) Esta expresión permite determinar la µ de una sustancia a partir de la distancia corrida por la misma y las condiciones de trabajo: voltaje aplicado, longitud efectiva del soporte utilizado y tiempo de corrida. Considerando que la diferencia de potencial está en relación con la corriente circulante en la tira (Ley de Ohm) también puede escribirse: (Ec. 13) Sin embargo, la movilidad electroforética es independiente de todas estas condiciones experimentales. Por qué? Experimentalmente se demuestra (Ud. lo hará en el TP) que si se varía una de ellas, variará la distancia corrida por la muestra pero la movilidad permanecerá constante dado que es una característica propia de la sustancia en un determinado medio. Si consideramos una de dichas variables experimentales, por ejemplo la longitud L del soporte de corrida, y variamos solamente su valor (manteniendo constantes V ab y tiempo de corrida), entonces variará la distancia recorrida por la partícula. En este caso la sustancia experimenta una modificación de su velocidad a expensas de la variación de la intensidad del campo eléctrico aplicado a los extremos de la tira (Ver ec. 12.a y 12.b). En todos los casos se mantendrá constante. La electroforesis puede utilizarse con fines analíticos o preparativos según cuál sea el objetivo perseguido: la identificación de sustancias o su separación cuando forma parte de una mezcla. Asimismo, según el diseño experimental puede utilizarse para determinar pesos moleculares, cuantificar sustancias, etc. En todos los casos es necesario aplicar las condiciones correctas para obtener una buena resolución de los componentes a analizar y/o separar. Se llama resolución a la capacidad de un sistema de distinguir como diferentes las distancias recorridas por dos sustancias distintas en las mismas condiciones de corrida. En las corridas electroforéticas, entre otras cosas, la elección del voltaje, de soportes adecuados y el tiempo de la corrida son los parámetros experimentales que deben contemplarse para obtener una buena resolución. Sobre los detalles del circuito eléctrico revisa el ANEXO y Seminario de este módulo Cátedra de Física-FFYB-UBA [10]