en el análisis de proteínas con interés biofarmacéutico

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1 Electroforesis capilar en el análisis de proteínas con interés biofarmacéutico productos biofarmacéuticos - José Carlos Diez-Masa. Instituto de Química Orgánica General (CSIC) La electroforesis capilar es una técnica analítica especialmente adecuada para el análisis de proteínas, que empieza a jugar un papel importante en el control de procesos y en el laboratorio de control de calidad de productos biofarcaéuticos. En este artículo se presentan los fundamentos de la electroforesis capilar y se describen sus diferentes modos utilizados para análisis de proteínas, ilustrándolos con algunos ejemplos de sus aplicaciones en el campo de las proteínas con interés biofarmaceútico. Electroforesis capilar La electroforesis capilar es una técnica analítica de separación que se basa en la diferente velocidad de desplazamiento que tienen las distintas proteínas en el seno de un medio líquido, contenido en un tubo capilar, al someterlas a la acción de Figura 1. Elementos esenciales de un instrumento de electroforesis capilar. un campo eléctrico. Los elementos esenciales de un instrumento de electroforesis capilar se muestran en la Figura 1. La separación se lleva a cabo en un tubo capilar (diámetro interno, d.i., µm, longitud cm), generalmente hecho de sílice fundida, que se llena con el tampón que constituye el medio de separación (BGE) a partir de los viales situados en los extremos del capilar. La muestra, contenida en otro vial, se introduce por uno de los extremos del capilar reemplazando en el momento de la inyección uno de los viales de tampón por el vial de muestra y aplicando en él una pequeña sobrepresión o un pequeño voltaje. El campo eléctrico necesario para llevar a cabo la separación se consigue conectando una fuente de alimentación de alto voltaje ( voltios, corrientes de microamperios) a los extremos del capilar de separación a través de los viales de tampón. La monitorización de la separación se lleva a cabo en columna, es decir colocando un detector en un punto del capilar de análisis situado generalmente antes del extremo de salida de éste. En los instrumentos comerciales, un ordenador se encarga del control de la instrumentación y de la adquisición y tratamiento de los datos suministrados por el detector. Algunas de las principales características de esta técnica son: 1. Elevada rapidez de análisis. Los tiempos de separación son generalmente de varias decenas de minutos. 2. Elevada eficacia de separación. En los análisis de proteínas suelen obtenerse eficacias en torno a los platos teóricos por metro de columna, dependiendo de la proteína a analizar y de las condiciones de separación. 3. Pequeños volúmenes de muestra. En cada separación de utilizan unos pocos (10 50) nanolitros de muestra. 4. La total automatización del análisis. Los instrumentos de electroforesis capilar permiten llevar a cabo los análisis sin la constante atención del operador. El análisis de proteínas por electroforesis capilar se puede llevar a cabo utilizando tres modos diferentes: electroforesis capilar en zona libre, electroforesis capilar en geles e isoelectroenfoque capilar, que respectivamente permiten realizar la separación de las proteínas en FARMESPAÑA INDUSTRIAL NOVIEMBRE/DICIEMBRE12 65

2 base a sus diferencias en carga eléctrica, en tamaño molecular y en punto isoeléctrico. Separación de proteínas en zona libre En este modo de separación, el capilar contiene sólo un tampón que permite fijar el ph del medio de separación y, por tanto, la carga eléctrica global de las proteínas. Al aplicar el campo eléctrico, cada proteína se moverá a una velocidad diferente dependiendo de su carga global. La Figura 2 esquematiza los fenómenos que ocurren en el interior del capilar durante la separación. Las proteínas, en el ejemplo una con carga global positiva y otra con carga global negativa, se mueven debido a dos fenómenos que tiene lugar simultáneamente: 1) el desplazamiento que sufre la proteína debido al campo eléctrico, y que depende de una propiedad de la proteína que se denomina movilidad electroforética, y 2) al desplazamiento global del tampón en el interior del capilar, el denominado flujo electroosmótico, que puede expresarse cuantitativamente mediante la movilidad electroosmótica. El flujo electroosmótico se origina Figura 2. Fenómenos que ocurren en el interior del capilar durante la separación y controlan el desplazamiento de las proteínas. El círculo con signo + representa una proteína con carga eléctrica global positiva y el círculo con signo, una con carga eléctrica global negativa. µ ef representa la movilidad electroforética de la proteína y µ representa la movilidad electroosmótica del tampón. Se esquematizan también la superficie interna del capilar, con sus cargas negativas, y la doble capa eléctrica formada sobre esta superficie interna. como consecuencia de la interacción entre los cationes del tampón de separación y los iones negativos que existen en la superficie interna del capilar de sílice fundida en contacto con el tampón, lo que origina una ligera acumulación de cationes en la zona próxima a la pared del capilar (doble capa eléctrica). En presencia de campo eléctrico, este exceso de cationes es atraído hacia el cátodo y arrastran con ellos a las moléculas de agua que los solvatan, originando el desplazamiento de todo el líquido contenido en el capilar hacia el cátodo. La velocidad y el sentido del desplazamiento efectivo de las proteínas vienen determinados por la movilidad aparente de éstas, que es la suma algebraica de la movilidad electroforética y la movilidad electroosmótica. En la separación de proteínas, la movilidad electroforética de éstas es generalmente mayor que la movilidad electroosmítica del medio de separación, por lo que la velocidad de desplazamiento de las proteínas se verá considerablemente afectada (incrementada o disminuida) por la movilidad electroosmótica del tampón. Durante la separación de proteínas en zona libre, si no se toman precauciones especiales, éstas pueden adsorberse sobre la pared interior del capilar, lo que conduce a una Figura 3. Electroforegrama del patrón europeo (PBR lote 3) para eritropoyetina. Condiciones analíticas: capilar de sílice fundida no recubierto, longitud 100 cm, d.i. 50 µm; tampón de separación: 0,01 M tricina, 0,01 M acetato sódico, 7 M urea y 2,5 mm 1,4-diamino butano; temperatura separación 25ºC; voltaje de separación 15 kv; detección UV 214 nm. (Tomada de prospecto de la EDQM para eritropoyetina lote 3, con autorización). mala separación de los componentes de la muestra, falta de repetibilidad en los análisis y bajas recuperaciones. Esta adsorción se debe a la interacción de las cargas negativas en la superficie del capilar con los aminoácidos cargados positivamente de la cadena polipeptídica de la proteína. Se han desarrollado diferentes estrategias para evitar esta adsorción. Uno de los procedimientos más efectivos es la adición al tampón de separación de sustancias orgánicas cargadas positivamente que puedan fijarse sobre la pared del capilar impidiendo la adsorción de las proteínas. Las aminas catiónicas divalentes, tales como 1,4-diaminobutano, 1,5-diaminopentano o 1,3-diaminopropano, se emplean en múltiples métodos de separación de proteínas para conseguir buenas separaciones. Así por ejemplo, utilizando un tampón de separación conteniendo entre otros componentes 1,4-diaminobutano, se ha conseguido la separación de diferentes isoformas de eritropoyetina recombinante (rh-epo) (Figura 3) [1] en un método aprobado por la Farmacopea Europea como parte del ensayo de identificación de esta proteína biofarmacéutca. Este tipo de aditivos ha sido también utilizado en el análisis otras proteínas recombinantes tales como el Factor VIIa [2] y el factor estimulante de las colonias de granulocitos (rh-gcsf) [3]. Algunos polímeros hidrófilos, tales como polibreno [4] o derivados de poliacrilamida [5], se han utilizado también como aditivos al tampón para separación de rhepo [6,7] en medios de separación que permiten el acoplamiento de la electroforesis capilar con la espectrometría de masas. Además de la elevada eficacia y resolución que estas sustancias proporcionan en la separación de proteínas, los 66 NOVIEMBRE/DICIEMBRE12 FARMESPAÑA INDUSTRIAL

3 métodos electroforéticos que los emplean tienen la ventaja de la facilidad de su puesta a punto, ya que basta con disolver estos aditivos en el tampón de separación para disminuir la adsorción de las proteínas durante el análisis. Separación de proteínas por tamaño molecular Este modo de electroforesis capilar está sustituyendo a algunos métodos de dodecil sulfato sódico electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PA- GE) en muchos laboratorios para el control de calidad de productos biofarmacéuticos. Los tampones de separación utilizados hoy en día en este modo de electroforesis capilar contienen, además de las sustancias para control de ph, un polímero hidrófilo, tal como polivinil alcohol, óxido de polietileno o diferentes derivados de celulosa. La función de este polímero es la formación de redes poliméricas que, debido a las interacciones de las cadenas del polímero en solución, permiten la separación de proteínas por tamaño. Para la preparación de este medio basta con disolver el polímero a una determinada concentración en el tampón. Esto facilita enormemente el desarrollo de los métodos analíticos y la repetibilidad del análisis, ya que el medio de separación puede ser regenerado dentro del capilar después de cada análisis. Este modo de separación requiere, en la mayoría de los casos, el uso de capilares recubiertos interiormente con un polímero unido a la pared del capilar de forma permanente (unión covalente). De esta forma, se disminuye o anula el flujo electroosmótico del capilar y se mejora la resolución de las proteínas. Al igual que en las técnicas de SDS-PAGE, las proteínas deben estar complejadas con Figura 4. Separación por tamaño molecular de muestras de un anticuerpo monoclonal reducido, alquilado con diferentes agentes de alquilación y derivatizado con una sustancia fluorescente. NGHC cadena pesada no glicosilada, LC cadena ligera, HC cadena pesada; IAA acido iodoacético, IAM iodoacetamida. Condiciones analíticas: capilares de sílice fundida no recubiertos, longitud 30 cm, d.i. 50 mm; tampón de separación: Bio-Rad SDS; temperatura de separación 20ºC; voltaje de separación 18 kv; detección por fluorescencia inducida por láser: argón ionizado 3,5 mw, excitación 488 nm, emisión 560 nm (Tomada de O. Salas-Solano, B. Tomlinson, S. Du, M. Parker, A. Strahan, S. Ma, Anal. Chem. 78 (2006) 6583, con autorización) 2006 American Chemical Society. un tensioactivo. Para ello, es necesario desnaturalizar previamente las proteínas calendándolas (normalmente a 90ºC durante 5 min) en una solución de un agente reductor de puentes disulfuro (mercaptoetanol o ditiotreitol son usados frecuentemente). El tensioactivo más empleado en este modo de separación es el SDS, que confiere a todas las proteínas la misma relación carga/masa independientemente de la longitud de su cadena polipeptídica. Este modo de electroforesis capilar, además de su uso para obtener información sobre la masa molecular de las proteínas [8], ha sido empleado para el análisis de bajas concentraciones de cadenas pesadas desglicosiladas (Figura 4) y otras alteraciones sufridas por los anticuerpos monoclonales durante su producción por métodos recombinantes [9]. Un estudio colaborativo ha demostrado la utilidad de un método comercial de electrofororesis capilar basado en este modo de separación para el control de calidad de anticuerpos monoclonales recombinantes [10]. Un método de electroforesis capilar que termite separar las proteínas por tamaño en tiempos de análisis muy cortos (menos de 5 min), ha sido desarrollado para el control de procesos en el cultivo de hibridomas y en la purificación de los anticuerpos obtenidos [11]. Separación de proteínas por punto isoeléctrico Las técnicas de isolectroenfoque en geles de poliacrilamida son técnicas de separación clásicas ampliamente empleadas en los laboratorios de control de calidad del sector biofarmaceútico para caracterizar proteínas. En estas técnicas se lleva cabo la separación de las proteínas en función de su punto isoeléctrico en un gradiente de ph formado a lo largo del gel por medio de anfolitos. La separación de proteínas por punto isoeléctrico se puede realizar también en formato capilar. El modo de isoelectroenfoque capilar combina las ventajas del alto poder de resolución del isoelectroenfoque en geles con la velocidad, eficacia y automatización de la electroforesis capilar. En isoelectroenfoque capilar las proteínas se separan también en un gradiente de ph formado por los anfolitos en el interior del capilar. Los anfolitos son sustancias anfóteras (generalmente ácidos poliaminocarboxílicos) que bajo la acción del campo eléctrico son capaces de distribuirse a lo largo del capilar, estableciendo un gradiente de ph en su interior. En este gradiente de ph, las proteínas de la muestra migran hasta que alcanzan una región del capilar en la que el ph es igual a su FARMESPAÑA INDUSTRIAL NOVIEMBRE/DICIEMBRE12 67

4 pi. En este punto, las proteínas adquieren carga cero y dejan de moverse bajo la acción del campo eléctrico. A este fenómeno se le denomina enfoque de las proteínas. Cada proteína se enfoca, por tanto, en un punto distinto del capilar. Las separaciones se llevan a cabo generalmente en capilares con la pared interior recubierta con un polímero unido a ella de forma covalente. De esta manera se disminuye o se suprime el flujo electroosmótico que podría dificultar el enfoque de las proteínas. Para llevar a cabo la separación se llena el capilar con una mezcla compuesta por los anfolitos, una solución de un polímero hidrófilo y la muestra. El vial que se conecta al ánodo de la fuente de alto voltaje contiene una solución diluida de un ácido (generalmente ácido fosfórico) y el que se conecta al cátodo, una solución diluida de una base (habitualmente hidróxido sódico). Al aplicar el campo eléctrico, se produce la migración de las proteínas hasta que se inmovilizan en su punto de enfoque. Para detectar las proteínas, una vez que éstas se han inmovilizado, es necesario desplazarlas al punto de la columna donde se encuentra el detector (movilización). Existen varios procedimientos para llevar a cabo esta movilización. El procedimiento más simple es aplicar una ligera sobrepresión de gas en el vial situado en el lado opuesto al detector mientras se mantiene conectado el campo eléctrico en el capilar para evitar el ensanchamiento de las bandas de las proteínas una vez que éstas se han enfocado. El isoelectroenfoque capilar como técnica de caracterización, control de procesos y control de calidad, no están todavía ampliamente introducidas en la industria biofarmacéutica. Esta situación puede cambiar con la comercialización creciente de los anticuerpos monoclonales. Durante la producción y almacenamiento de éstos, pueden sufrir alteraciones tales como desamidación, variaciones en la lisina C-terminal y alteraciones en la glicosilación, que pueden conducir a cambios en la carga eléctrica global de las diferentes isoformas de los anticuerpos, modificando su actividad. Es necesario, por tanto, un cuidadoso seguimiento de estas alteraciones y el isoelentroenfoque capilar es una técnica adecuada para ello. Un reciente estudio colaborativo [12], llevado a cabo en doce laboratorios utilizando diferentes lotes de anfolitos y diferentes instrumentos, ha puesto de manifiesto que el valor del pi de cada una de las variantes de carga eléctrica pudo determinarse con buena precisión (RSD 0.5%) entre laboratorio, y que la precisión en el porcentaje de área de picos de las diferentes variantes también fue aceptable (RSD 4%). Estos resultados muestran que el isoelectroenfoque capilar puede ser una técnica analítica valida en el control de calidad de los anticuerpos monoclonales. Detección de proteínas en electroforesis capilar El detector más empleado en electroforesis capilar es el basado en la absorción de luz ultravioleta por la muestra (detectores de UV). La detección se lleva a cabo en el propio capilar de separación, evitando así el ensanchamiento de la banda de las proteínas durante su monitorización. En el detector de UV más simple, la luz producida por una lámpara de deuterio, después de pasar por un filtro óptico o un monocromador, es colimada a través del diámetro interno del capilar. Al otro lado de éste, un fotosensor mide la cantidad de luz que deja pasar la muestra. Puesto que el diámetro interno del capilar es muy pequeño (10 75 µm) el camino óptico a través de la muestra será muy corto y el límite de detección será veces peor que el que se tiene con este mismo tipo de detector en otras técnicas de separación, tal como la HPLC. En electroforesis capilar con detectores UV, el límite de detección para las proteínas es del orden de 10-6 M. Cuando se necesita un mejor límite de detección, se puede emplear el detector de fluorescencia. Este tipo de detector utiliza la luz de un láser, habitualmente con emisión en la región visible del espectro, o de un diodo electroluminiscente (LED) para excitar la fluorescencia de la muestra en el propio capilar de separación. La fluorescencia emitida por la muestra es colectada utilizando un sistema óptico y medida con ayuda de un fotomultiplicador o un diodo de avalancha. Muy pocas proteínas pueden producir fluorescencia al ser excitada con luz visible. Por eso se recurre frecuentemente a la derivatización de las proteínas con una sustancia fluorescente para conseguir detectarlas cuando su contenido en la muestra es bajo (< 10-6 M). La derivatización de las proteínas contenidas en la muestra a éstas concentraciones, como es el caso de muchas muestras biológicas, no es sencilla de llevar a cabo, debido a la formación de múltiples derivados de las proteínas con la sustancia fluorescente y por la lenta velocidad de reacción de éstas a bajas concentraciones. En algunos casos, la derivatización de la muestra en el interior del capilar de separación (derivatización en-capilar) puede dar buenos resultados [13]. Utilizando esta técnica de derivatización se pueden detectar algunas proteínas que se encuentran a una concentración de M en la muestra [13]. Conclusiones En este artículo se han presentado brevemente los modos de electroforesis capilar que pueden ser aplicables a la separación de proteínas. Los ejemplos presentados muestran que la electroforesis capilar tiene interés en el control de procesos y en el control de calidad en la fabricación de proteínas con aplicaciones biofarmacéuticas. Agradecimientos El autor agradece al MINECO por la ayuda económica (Proyecto CTQ ) y a R. Garrido-Medina por ceder la Figura 1 para este trabajo Referencias Chromatogr. A Chromatogr Anal. Chem - Electrophoresis - Anal. Chem Electrophoresis Anal. Chem Anal. Chem - - Chromatographia Mol. Biol - Chromatographia Anal. Chem 68 NOVIEMBRE/DICIEMBRE12 FARMESPAÑA INDUSTRIAL

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