Electroforesis Bidimensional de proteínas. Lucía Monteoliva Díaz

Transcripción

1 Electroforesis Bidimensional de proteínas Lucía Monteoliva Díaz

2 Separación de proteínas ELECTROFORESIS: 1D, 2D ALTERNATIVAS A LA 2D: CROMATOGRAFÍAMULTIDIMENSIONAL Y ELECTROFORESIS CAPILAR

3 Análisis proteico Electroforesis (transporte bajo la acción de un campo eléctrico) -Herramienta analítica indispensable, útil para: separar y comparar mezclas proteicas evaluar pureza de una proteína estimar cantidad de una proteína detectar proteolisis detectar modificaciones proteicas estimar características físicas de una proteína - Geles de muy diversos tamaños y naturaleza

4 ELECTROFORESIS MONODIMENSIONAL EN CONDICIONES DESNATURALIZANTES (SDS-PAGE) Fácil de realizar Reproducible Resuelve proteínas de kda de masa molecular CARACTERIZACIÓN DE PROTEÍNAS DESPUÉS DE UNA PURIFICACIÓN. COMPLEJOS PROTEICOS

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6 Electroforesis bidimensional en la separación de proteínas Klose, Protein mapping by combined isoelectric focusing and electrophoresis of mouse tissues. A novel approach to testing for induced point mutations in mammals. Humangenetik 26(3), O Farrell, High Resolution Twodimensional Electrophoresis of proteins. The Journal of Biological Chemistry 250, Anderson and Anderson, The human protein index. Clinical Chemistry, 28,

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10 Electroforesis Bidimensional 1ª D: Isoelectroenfoque (pi) 2ª D: SDS-PAGE (PM) pi pi PM PM

11 Fundamentos bioquímicos de la primera dimensión LAS PROTEÍNAS SON MOLÉCULAS ANFOTÉRICAS: carga neta suma de las cargas de los AA de las cadenas laterales y de los extremos NH2 y COOH La carga de los aa de las cadenas laterales cambia dependiendo del ph del medio PH ÁCIDO GRUPOS CARBOXILO GRUPOS AMINO (+) PH BÁSICO GRUPOS CARBOXILO (-) GRUPOS AMINO

12 Fundamentos bioquímicos de la primera dimensión En un gradiente de ph y bajo la influencia de un campo eléctrico las proteínas se mueven hasta la zona donde la carga neta es 0 pi

13 Gradiente de ph La capacidad de resolución depende de: -formación de un gradiente de ph adecuado -fuerza del campo eléctrico Gradientes de ph inmovilizados: Inmovilinas Tiras de IPG Campo eléctrico: Voltajes muy elevados (8000) Voltios-hora (Vh)

14 Immobilized ph Gradients (IPGs) L, NL standard gradients zoom-in gradients acidic extreme basic extreme wide gradients

15 Solubilización de la muestra Las muestras son desnaturalizadas y completamente solubilizadas para una óptima separación. AGENTES REDUCTORES: DTT, TBP AGENTES CAOTRÓPICOS: UREA,TIOUREA DETERGENTES: no iónicos o zwiteriónicos: CHAPS, NP40 ANFOLITOS: aumentan conductividad de la muestra

16 Primera Dimensión: cup loading

17 Primera Dimensión: Rehidratación en gel Gran capacidad de carga

18 1. Step 300 V 3. Gradient V 3 h 4. Gradient V 3 h 5. Step V 4 h 6. Step 500 V IPGTMphor IEF unit Voltios hora 3h

19 EQUILIBRADO DE LA TIRA 1 REDUCCIÓN DE PUENTES DISULFURO DTT 2. ALQILACIÓN Iodoacetamida: (alquila los SH para evitar reoxidaciones) Tris, ph adecuado para electroforesis urea: desnaturaliza SDS: desnaturaliza y carga negativamente

20 Colocación de la tira sobre la segunda dimensión

21 Segunda Dimensión

22 Fundamentos bioquímicos de la segunda dimensión: SDS-PAGE Proteínas + SDS+ Ag. REDUCTOR Aplicación de un campo eléctrico TODAS LAS PROTEÍNAS IGUAL CARGA SEPARACIÓN EN FUNCIÓN DE SU PM

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24 Proteómica Clásica: Diseño Experimental Muestra Separación y detección Análisis de imagen Escisión y digestión Identificación Mass (m/z)

25 Proteómica Clásica: Diseño Experimental Muestra Separación y detección Análisis de imagen Escisión y digestión Identificación Mass (m/z)

26 Preparación de la muestra ELECCIÓN Tipo de muestra Extracto total Condiciones a estudiar Fracción o compartimiento celular Complejos proteicos Distintas variaciones Condiciones estándar : Mapa de referencia

27 Elección de muestra adecuada Interacciones Genotipo Tipo de célula Condiciones de crecimiento Edad Medio de cultivo Enfermedad Fármacos FENOTIPO PROTEÓMICO: fenotipo que puede ser observado con métodos proteómicos Determinado por: GENOTIPO+AMBIENTE 1 ORGANISMO= INFINITOS PROTEOMAS

28 Preparación de la muestra Rotura celular Precipitación de proteínas Solubilización Protección frente a proteasas Eliminación de : Ácidos nucleicos Lípidos Sales Material insoluble Fraccionamiento. Proteomas y subproteomas

29 Solubilización de la muestra Las muestras son desnaturalizadas y completamente solubilizadas para una óptima separación. AGENTES REDUCTORES: DTT, TBP AGENTES CAOTRÓPICOS: UREA,TIOUREA DETERGENTES: no iónicos o zwiteriónicos: CHAPS, NP40 ANFOLITOS: aumentan conductividad de la muestra

30 Extracción: Comparación Urea vs. Urea/Tiourea Rat liver 8 M urea 7 M urea / 2 M thiourea

31 Eliminación de componentes no proteicos POLISACÁRIDOS, Ac. Nucleicos, Lípidos: VISCOSIDAD DE LA MUESTRA Digestión con nucleasas Sonicación

32 Efecto de las sales Extracto de E. coli ph 4-7 no salt 30 mm NaCl

33 Precipitación de la muestra Extracto de E. coli precipitado con TCA/acetone y resuspendido Lisado de E. coli

34 Efecto de la diálisis ph 3-10 NL Sin dializar ph 3-10 NL Dializado

35 Reference intervals for 70 protein analytes in plasma Anderson, N. L. (2003) Complejidad de la célula eucariota Mol. Cell. Proteomics 2: 50 Rangos muy variables de concentraciones de las distintas proteínas en una muestra compleja Fraccionamiento: 1. Subproteomas 2. Distintos rangos de ph

36 Immobilized ph Gradients (IPGs) L, NL standard gradients zoom-in gradients acidic extreme basic extreme wide gradients

37 IPG 4-7 Resolución Yeast 1564 Wildgruber et al., Electrophoresis IPG IPG IPG 5,5-6,7 1429

38 Visualización de las proteínas Tinción con Azul de Coomassie (100ng-1µg) Tinción con plata (1-10ng) Compuestos fluorescentes: Autorradiografía de proteínas marcadas Fluorocromos: DIGE Transferencia a membrana: SYPRO-RED, SYPRO-RUBY (1-10ng) Sypro Ruby Ab Tinciones Tinción de Plata amoniacal

39 Detección de Proteínas VENTAJAS DESVENTAJAS NITRATO DE PLATA Muy sensible Método de elección Proteínas no se tiñen Impurezas impiden tinción Poco rango dinámico lineal (fácil saturación) AZUL DE COOMASIE Fácil de realizar No es muy sensible SYPRO-RUBY Rápido Muy sensible Muy caro ISÓTOPOS RADIACTIVOS Muy sensible Trabajar con radiactivos DIGE: aumenta rango dinámico

40 Sistemas de adquisición de imágenes Densitómetro reflectancia y transmitancia Fluor-S / Fluor-S Max MultiImager CCD Based UV / Visible, Fluorescence & Chemiluminescence

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42 ANÁLISIS DE IMAGEN Melanie, PDQuest, ImageMaster Platinium software programs Proteómica de expresión: Cuantificación y comparación

43 Análisis de imagen Adquisición Gel: transmitancia Membrana: reflectancia Análisis de imagen SOFTWARE Detección y cuantificación de manchas Etiquetado de las proteínas (mapas de referencia) Comparaciones de geles (entre si, con bases de datos) Almacenamiento Selección de proteínas: identificación

44 CUANTIFICACIÓN Y COMPARACIÓN

45 EttanTM Spot Picker EttanTM Digester

46 Resultados obtenidos MW pi

47 Ventajas de la 2D-PAGE REPRODUCIBILIDAD Establecer mapas de referencia Detección de cambios de proteoma Bases de datos de mapas MAXIMA CAPACIDAD DE CARGA Procesos de identificación En electroforesis preparativa RESOLUCIÓN Detección máximo número de manchas Diferenciación y visualización de distintas formas de una misma proteínas

48 Limitaciones de la 2D-PAGE Técnica laboriosa, difícil de automatizar Proteínas muy grandes o muy hidrofóbicas no entran en el gel Proteínas poco abundantes no se visualizan Proteínas muy ácidas o muy básicas no se resuelven bien