EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
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- Juan Antonio Zúñiga Bustamante
- hace 7 años
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1 EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
2 Consideraciones iniciales - Condiciones de limpieza y esterilidad - Peligrosidad de algunos reactivos usados en la purificación
3 Fases - Rotura-homogeneización: obtención de un lisado celular - Bacterias: lisozima - Plantas y hongos: rotura mecánica y/o enzimas específicas (celulasas, quitinasas) - Células animales: detergente - Rotura mecánica: macerado con nitrógeno líquido, prensa de French, homogeneizador, sonicación. - Purificación: separación de los ácidos nucléicos del resto de componentes celulares - Extracción con solventes orgánicos, precipitación de proteínas y otras impurezas - Concentración: mediante precipitación - Lavado y resuspensión
4 Rotura-homogeneización - Prevenir la degradación del ADN - Evitar rotura física del ADN - Impedir acción de nucleasas: EDTA (Ácido etilendiaminotetraacético) - Detergentes: SDS, desestabilizan las membranas celulares - Proteinasa K: degrada proteínas - Buffer rotura, composición típica: Tris, EDTA, SDS, CTAB Purificación - Extracción con fenol-cia (1:1) (CIA: cloroformo:alcohol isoamílico 24:1) - Acetato potásico: elimina proteínas SDS y lípidos, precipitados por centrifugación
5 Concentración - Precipitación con alcoholes: etanol (2.5:1) o isopropanol (0,7:1), en presencia de cationes monovalentes (Na +, K +, NH 4+ ) - Centrifugación en frío - Lavado con etanol 70%. Secado. - Resuspensión en TE (Tris-HCl 10 mm, EDTA 1 mm, ph 8) Purificación mediante columnas - Gel filtración: separación por tamaño - Columnas de afinidad, intercambiador aniónico
6 Purificación de ADN plasmídico - Lisis alcalina - Rotura: tampón con glucosa, lisozima, EDTA - Desnaturalización: tampón con SDS, NaOH - Purificación: acetato potásico en solución ácida - Boiling - Rotura, hervido, hielo, centrifugación. -Columnas de afinidad - Gradiente de cloruro de cesio
7 Purificación de ADN plasmídico - Gradiente de cloruro de cesio - Utiliza un gradiente de cloruro de cesio y el agente intercalante bromuro de etidio para generar diferencias de densidad entre el ADN superenrrollado plasmídico (ccc) y el ADN lineal cromosómico o plasmídico circular abierto (oc). El superenrrollado acepta menos BrEt y será más denso, apareciendo más abajo tras la centrifugación
8 Cuantificación de ácidos nucleicos - Electroforesis - Marcadores de peso molecular de concentración conocida, comparar la intensidad de la señal tras la tinción con bromuro de etidio. Densitometría - Espectrofotometría nm (máxima absorbancia de ácidos nucléicos) nm (máxima absorbancia de proteínas) - ADNss: 1.0 OD = 33 µg/µl - oligonucleótidos: 1.0 OD = 20 µg/µl - ADNds: 1.0 OD = 50 µg/µl - ARNss: 1.0 OD = 40 µg/µl Para ADN puro: A 260 /A 280 = Para ARN puro: A 260 /A 280 = 2.0
9 EXTRACCIÓN DE ARN
10 Fases - Material de partida - Siempre fresco o congelar inmediatamente, preferiblemente en nitrógeno líquido. - Evitar acción ARNasas: espacio de trabajo limpio, siempre guantes, tratar en autoclave todo el material dos veces o en horno a 260ºC durante 12 h. Todas las soluciones tratadas con DEPC (dietil pirocarbonato) 0.1% (mezclar por agitación durante 2-3 h al menos y luego tratar en autoclave), excepto las que llevan Tris, para éstas usar H 2 O DEPC ya esterilizada de partida. El DEPC inactiva las RNAsas por carboxietilación de determinados aminoácidos. - Rotura: similar al caso del ADN, conveniente hacerlo en frío, por ejemplo nitrógeno líquido. Rápidamente añadir buffer de rotura. - Purificación: Varios sistemas. -Mezclas tipo Trizol (Invitrogene): Isotiocianato de guanidina. Precipita las proteínas y permite una separación de los diferentes componentes celulares: ADN, ARN, proteínas, etc - Extracciones con fenol-cloroformo y precipitación selectiva con LiCl 0.2 M. Siempre quedan trazas de DNA, deben eliminarse con ADNasa libre de ARNasas, sobre todo si se va a realizar RT-PCR -Columnas RNeasy de Qiagen: ARN de muy buena calidad, algo de contaminación con ADN.
11 - Almacenamiento En H 2 O DEPC a -80ºC durante semanas-meses. A -20ºC es mucho más inestable. También precipitado con etanol/sal a -80ºC Típico gel de agarosa con ARN de hongos teñido con BrEt - Las bandas intensas corresponden a los ARN ribosomales (aprox. 80% del total en la célula), aproximadamente 3.4 y 1.7 kb de tamaño - El ARNm no representa más del 2-5% del total y aparece como un barrido o a veces no es visible ARN total o ARNm? - Para la mayor parte de usos ARN total puede ser utilizado: Northern, RT-PCR - ARNm es imprescindible para construcción de bibliotecas de ADNc y para el marcaje de sondas para hibridación de microarreglos.
12 Purificación de ARNm - Columnas de oligo(dt)-celulosa - Retienen el ARNm al tener una cola de poly-a en 3. Una ronda elimina entre 50-70% ARNr, se pierde entre un 20 y un 50% del total de ARNm. Una segunda ronda elimina hasta 95% de ARNr y es imprescindible para marcaje de cdna en microarrays. - Dyna-beads - Dyna-beads (de Dynal), recubiertas con oligo(dt) pemiten separar eficientemente el ARNm mediante separación magnética Bolita magnética Streptavidina Oligo-dT 25 nucleótidos Biotina Molécula de ARNm
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