Electroforesis en gel de DNA

Transcripción

1 Electroforesis en gel de DNA Método analítico de visualización del DNA basado en la migración del DNA a través de un gel Gel Polímero de agarosa Polímero de acrilamida o poliacrilamida il V = q E / f V= velocidad de migración E= gradiente de potencial eléctrico (Volts/cm) q= carga eléctrica efectiva de la partícula f= coeficiente de fricción (tamaño y forma) 1

2 Gel electrophoresis of DNA 2

3 Electroforesis en gel de DNA Gel de poliacrilamida Tinción con nitrato de plata Marcaje radiactivo Marcaje fluorescente Electroforesis vertical 3

4 Aspectos que afectan la migración del ADN Tamaño del DNA Tamaño del poro (concentración del gel) Voltaje aplicado Conformación del DNA V = q E / f 4

5 Aspectos que afectan la migración del ADN 5

6 6

7 Amplificación de DNA In vivo Clonamiento In vitro PCR 7

8 Clonamiento Amplificación IN VIVO de secuencias determinadas de DNA basada en el uso de: -Vectores -Ligasa -Células vivas -etc 8

9 Tipos de vectores de clonamiento Plasmidio - Molécula de DNA circular extracromosómico que se replica de modo autónomo dentro de una célula bacteriana Límite de clonación: 100 a 10,000 pb ó kb. Fago - Derivado del bacteriófago lambda; moléculas de DNA lineal, su DNA puede ser reemplazado por DNA extraño sin alterar el ciclo celular. Límite de clonación: 8-20 kb. Cosmidio - Molécula de DNA circular extracromosómica que combina aspectos de plasmidios y fagos; Límite de clonación: kb. 9

10 Tipos de vectores de clonamiento Bacterial Artificial Chromosomes (BAC) - Basados en plasmidios mini -F bacterianos. Límite de clonación: kb. Yeast Artificial Chromosomes (YAC) - Cromosoma artificial que contiene telómeros, origen de replicación, un centrómero de levadura y un marcador para su identificación en células de levadura. Límite de clonación: kb. 10

11 Introducción de un fragmento de DNA en un plasmidio 11

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14 Los vectores plasmidiales: Un poco de historia Amp r Amp r Tet r Aumento Nº copias 14

15 Amp r, Tet r, Cm r 15

16 Selección de recombinantes Inactivación por inserción versus α-complementación 16

17 17

18 18

19 Clonamiento por inserción direccional 19

20 Transcripción in vitro Salmonella typhimurium SP6 phage 20

21 OP 21

22 Serie de vectores plasmidiales puc. Selección de recombinantes por α- complementación Carece del gen rop y tiene una mutación t s en el RNA II. A 37ºC puede llegar a 70 copias por célula y a 42ºC más de 200 copias por célula. Posee los primeros 58 aa de la β-galactosidasa (péptido alfa o α). Dentro del péptido α posee un sitio de múltiple clonamiento (MCS) en perfecto marco de lectura con el péptido α. 22

23 Polylinker o Multiple Cloning Site (MCS) puc18 Polylinker o Multiple Cloning Site (MCS) puc19 23

24 α - complementación es una complementación Intra-alélica E. coli JM109 (F trad36 proa+b+ laci q (laczm15/ (lac-proab)glnv44 e14 gyra96 reca1 enda1 thi hsdr17 Cromosoma AL + Xgal β-gal - F C-terminal β-gall Amp s Colonias blancas Transformación con puc o derivado Cromosoma AL + Xgal β-gal+ /Colonias azules F Amp r α-complementación (+) 24

25 Principal ventaja: Screening Azul/Blanco Cuando se inserta un fragmento de DNA en el polylinker el péptido α no se produce. Medio de cultivo rico+amp Por lo tanto colonias bacterianas que poseen el plasmidio con un inserto de DNA son blancas. 25

26 Principal ventaja: Screening Azul/Blanco Inductor: ISOPROPYL-ß-D- THIOGALACTOPIRANOSIDO (IPTG) Indicador colorimétrico: 5-bromo bromo- 4-chloro-3-indoxyl-beta-D- galactopiranosido (X-gal), colonies turn blue 26

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30 Células bacterianas hospederas deben cumplir algunos requisitos 30

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33 METODOS DE TRANSFORMACION 33

34 Electroporation 200 ohms 2.5kV Time constant msec 25μF Field strength 12.5 kv/cm Electrode gap cm 40 μl 4ºC 34

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36 Gen Gun Biobalística (bombardeo con partículas) 36