2017 Guillermo Repizo

Transcripción

1 2017 Guillermo Repizo

2 El ADN recombinante es una molécula de ADN formada por recombinación de fragmentos de ADN de orígenes diferentes.

3 Análisis de la función en la célula huésped, estudios de localización, etc.: no se requiere purificación. Estudios de la proteína in vitro, cristalografía, espectroscopía, producción de anticuerpos, etc.: producción a baja y mediana escala. Producción de la proteína a gran escala: por ejemplo para comercialización.

4 Elección de la secuencia a clonar Elección del vector apropiado y del huésped apropiado Cómo optimizar la expresión de la proteína de interés Método correcto de extracción y clarificación Esquema de purificación Correcto almacenamiento de la proteína purificada

5 Procariotas Bacterias: Escherichia coli. Simple, barato y veloz. Muchos vectores y cepas comerciales. Bacterias lácticas. Bacillus Eucariotas Levaduras: Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis. Células de insecto: Sf9, Sf21 (tejido de ovario de la pupa de Spodoptera frugiperda) mediante baculovirus. Modificaciones post-traduccionales más complejas, mejor plegado. Células de mamíferos: mediante plásmidos, adenovirus, retrovirus, etc. Cultivo con muchos requerimientos. Permiten producción de hormonas, Ac, etc. Animales y plantas transgénicos. Ej. Producción de proteínas en leche. Altamente costoso.

6 Tamaño: las proteínas citosólicas pequeñas (<100 aas.) y péptidos se expresan mejor en E. coli y como proteínas de fusión. Las >100 aas. Son problemáticas en cualquier sistema. En E. coli suelen ser inestables y formar cuerpos de inclusión insolubles. Cantidad: Si se necesita mucha cantidad conviene explorar varias combinaciones vector/huésped/esquema de inducción/esquema de purificación. Actividad: No es necesaria (ej. producción anticuerpos), entonces sirven los cuerpos de inclusión o los tags para purificación por afinidad. Actividad necesaria, es importante mantenerla o re-establecerla; la facilidad de la purificación se vuelve secundaria. Estudios estructurales: Es mejor expresarla como proteína soluble (minimizar el mal plegamiento y la desnaturalización in vitro).

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8 Expresión en E. coli Necesito un vector de expresión: -plásmido molécula de dsadn circular. auto-replicativo multicopia

9 Expresión en E. coli Promotor: o lac: puc, ptz, psk, pbluescript, pgem, etc. Represor lac, inducible por IPTG: isopropil-ß-dtiogalactósido (muy costoso). Vectores diseñados para selección de colonias azules/blancas por interrupción del gen de la ß-galactosidasa. No tan fuerte pero en plásmidos de alto nº de copias los niveles de expresión son respetables.

10 Bacteria huésped que lo expresa o incluido en el plásmido X-gal: 5-bromo-4-cloro-3- indolil-β-d-galactopiranósido IPTG: no metabolizable

11 Expresión en E. coli Promotor: o tac y trc: ptrchis-topo, pgex Fuerte. Fusiones entre promotores trp (región -35) y lac (región -10), éstos son regulados por el represor lac. Son 3 veces más fuertes que trp y 10 veces más fuertes que lac

12 Expresión en E. coli Promotor: o T7: pet Requiere la ARN polimerasa del bacteriófago T7 que es MUY activa y específica para su promotor. Generalmente se utilizan en cepas que expresan T7 ARN polimerasa bajo el control del represor lac.

13 BL21 (DE3) plyss: o Defectiva en las proteasas lon y OmpT (membrana externa) o Sensible a rifampicina (se puede inhibir la ARNpol endógena) o Lisógeno λde3: contiene secuencia de la ARNpol del bacteriófago T7 (bajo control promotor lac) o Si tiene el plásmido plys expresa la lisozima de T7 en niveles bajos: se une a T7 ARNpol e impide la transcripción (ayuda a la ruptura celular: específica para el peptidoglicano de la membrana externa)

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15 Proteína de fusión -minimiza degradación -aumenta la solubilidad

16 Es crítico mantener la fase para obtener la proteína de fusión

17 Expresión en E. coli Promotor: o λp L : otros pet Promotor p L del bacteriófago λ, fuerte. Represor termo sensible cits857 (cepas que lo expresan): reprime a baja temperatura (30 C) pero no a altas (42 C). Productos tóxicos para la bacteria huésped.

18 Expresión en E. coli Terminador de la transcripción: o T7, t0 (fago λ), T1 del operón rrnb Intrínsecos (Rho-independientes): secuencia rica en GC que forma una horquilla, seguida de un tramo- U. Desestabilizan el complejo de la ARNpol y lo disocian.

19 Expresión en E. coli Eficiencia de la traducción: o Inciación: Sitio de unión de ribosomas corriente arriba del ATG. Secuencia de Shine-Dalgarno. 5-9 nucleótidos; 5-7 nucleótidos del AUG; interactúa con el extremo 3 del ARN 16S. o Uso de codones: Cambiar los codones raros (especialmente en el extremo 5, o aminoterminal de la proteína) o usar cepas especiales.

20 Expresión en E. coli 1 colonia aislada Hasta 50 ml 37ºC hasta DO 600 = 0,4-1 Antibiótico Buena agitación y aireación Cosecha: centrifugación a 6000 g por 20 min. Conservar a -20ºC

21 Plásmidos: o Vector shuttle. Los pasos de clonado en bacterias (Ori, resistencia clonado, etc.). antibióticos, sitios múltiple o Estable/transiente. o Promotores y señal de poliadenilación que funcionen en estas células. Promotores constitutivos fuertes de virus (pcmv, psv40), regulables (on y off, dosis dependiente). PoliA de BGH, SV40.

22 Expresión de proteínas para su purificación. Expresión de proteínas para estudiar su efecto sobre el fenotipo celular. Estudio de promotores y elementos regulatorios. Estudio de mecanismos involucrados en el procesamiento del RNA, postraduccionales, etc. Estudio de interacción de proteínas. Estudio de localizacion subcelular de proteínas.

23 o o o Gen reportero: t-pa: tissue plasminogen activator (se secreta, forma zonas trasparentes en un gel de fibrina y plasminógeno). Sensible, no cuantifica, sólo identifica. GFP: green fluorescent protein (microscopio y FACS). Fusión N- o C- terminal. Dirigidos a distintas localizaciones subcelulares. CAT: Chloramphenicol acetyltransferase (ensayo de actividad). No hay actividad en células eucariotas, no es tóxico para ellas. Ensayo de alta sensibilidad y reproducibilidad. o β-gal: β-galactosidase. MUG (fluorómetro), ONPG (espectrofotómetro), X-gal (histoquímica), FDG (FACS). o Firefly luciferase: oxida luciferina (ATP, Mg 2+ ) liberando un fotón.

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