1. Biotecnología y biotecnología farmacéutica: recorrido histórico. Características y tipos de biofármacos... 19
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- Asunción Salas Montoya
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1 Índice Índice de autores Prólogo Biotecnología y biotecnología farmacéutica: recorrido histórico. Características y tipos de biofármacos Introducción a la Biotecnología y a la Biotecnología Farmacéutica Historia de la Biotecnología La Biotecnología primitiva La Biotecnología clásica La Biotecnología molecular Origen de los biofármacos Definición y características de los biofármacos Relevancia económica y aplicaciones clínicas de los biofármacos Biofármacos: las proteínas terapéuticas Ventajas de las proteínas recombinantes Tipos de proteínas terapéuticas Los anticuerpos monoclonales Plataformas de producción de proteínas terapéuticas Biofármacos basados en ácido nucleicos: Terapia génica Oligodeoxinucleótidos antisentido (ASOS) sirna (RNAs de interferencia pequeños) Biosimilares... 37
2 Fundamentos prácticos de tecnología farmacéutica 1.9. El futuro próximo Bibliografía Preguntas de repaso Técnicas básicas de manipulación de DNA in vitro Introducción a la tecnología del DNA recombinante (rdna) Métodos de obtención y purificación de DNA Origen del DNA Sistemas de purificación de DNA Enzimas utilizadas en tecnología de DNA recombinante Endonucleasas de restricción DNA ligasas Otras enzimas de interés Concepto de vector genético Plásmidos Fagos y cósmidos Vectores virales Cromosomas artificiales Clonación en levaduras Introducción de DNA en células Introducción de DNA en células microbianas Incorporación del DNA en vegetales y células de mamífero Selección de clones recombinantes Construcción de genotecas de DNA Bibliotecas de DNA genómico Bibliotecas de cdna Sistemas de rastreo de genotecas Consideraciones finales y expectativas de futuro para la tecnología del DNA recombinante Bibliografía Preguntas de repaso Utilidades de la PCR en Biotecnología microbiana Historia Fundamento Diseño de la PCR Diseño de cebadores
3 Índice Orientación Secuencia Longitud Temperaturas de hibridación Haltan Estructuras secundarias y complementariedad Condiciones del ensayo Tipos de polimerasas Contaminaciones Utilidades Marcaje de sondas de DNA Clonación Mutagénesis PCR especiales Diagnóstico Conclusiones Bibliografía Preguntas de repaso Tecnologías de secuenciación masiva de DNA Introducción Tecnologías de secuenciación masiva de DNA Antecedentes: Secuenciación Sanger de DNA Características principales de la secuenciación masiva Diversas aproximaciones técnicas: Diferentes plataformas Preparación del DNA molde Secuenciación Generación de datos Aplicaciones de las Técnicas de secuenciación masiva de DNA en Genómica Funcional Fundamento y aplicaciones del RNA-Seq Caracterización de regiones de interacción DNA-Proteína: ChIP-Seq Metagenómica: Análisis del microbioma Bibliografía Preguntas de repaso El sistema CRISPR como herramienta en biotecnología Introducción a metodología CRISPR Breve historia del CRISPR
4 Fundamentos prácticos de tecnología farmacéutica 5.3. Funcionamiento básico CRISPR Aplicaciones en biotecnología Edición genómica Manipulación genética Expresión génica y epigenética Motores génicos Visualización de locus in vivo Perspectivas Bibliografía Preguntas de repaso Manipulación in silico de secuencias de ácidos nucleicos y proteínas Conceptos básicos y formatos Manipulación de secuencias de ácidos nucleicos y proteínas Análisis de propiedades de secuencias Identificación de señales sencillas en secuencias Búsqueda de genes en ADN Métodos directos o basados en homología Métodos indirectos o basados en principios básicos Métodos combinados Ensamblaje de secuencias Bibliografía Preguntas de repaso Bases de datos y comparación de secuencias Bases de datos Bases de datos bibliográficas Bases de datos de secuencias Alineamientos Matriz de puntos (dot matrix) Algoritmos de programación dinámica Métodos heurísticos (BLAST) Identificación de motivos conservados en proteínas Bibliografía Preguntas de repaso
5 Índice 8. Sistemas de producción a gran escala. Fermentadores y condiciones de cultivo Introducción Factores y parámetros críticos que afectan al crecimiento y producción del producto de interés Procesos de fermentación Fermentación discontinua (batch) Fermentación alimentada (fed batch) Fermentación continua Tipos y tamaños de fermentadores Partes de un fermentador agitado Diseño y fabricación de fermentadores Etapas en el diseño y fabricación de fermentadores Factores de diseño de un fermentador Bibliografía Preguntas de repaso Expresión heteróloga de proteínas en microorganismos procarióticos y eucarióticos Introducción Sistemas microbianos para la expresión de proteínas heterólogas Bacterias Levaduras y hongos filamentosos Problemas que plantea la expresión heteróloga en microorganismos Presencia de intrones Diferencias en el código genético y uso de codones Modificaciones postraduccionales Estabilidad de la proteína Optimización de la expresión heteróloga en microorganismos Elección del vector Elección del promotor y terminador de la transcripción Fusiones génicas Mejora cualitativa de la proteína Optimización de las condiciones de cultivo Bibliografía Preguntas de repaso
6 Fundamentos prácticos de tecnología farmacéutica 10. Producción microbiana de proteínas recombinantes y metabolitos de uso farmacológico Visión general de la producción de proteínas terapéuticas recombinantes Proteínas terapéuticas recombinantes producidas en Escherichia coli Producción en Escherichia coli de anticuerpos monoclonales y fragmentos de anticuerpos Proteínas terapéuticas producidas en levadura Producción de VLPs en levaduras como formas de inmunización Insulina: tipos y obtención Perspectiva histórica Estructura y actividad de la insulina Análogos de la insulina Plataformas de producción de insulina Producción de metabolitos primarios y secundarios. Ingeniería metabólica Mejora de la síntesis de antibióticos y antiparasitarios mediante ingeniería metabólica Producción de metabolitos primarios por microorganismos recombinantes Utilización de la ingeniería metabólica para la identificación de nuevos metabolitos Bibliografía Preguntas de repaso Descubrimiento y desarrollo de moléculas con actividad farmacológica Introducción Un poco de historia Para empezar, la enfermedad Buscando un nuevo fármaco Cuánto cuesta? La diana terapéutica Identificación de nuevas dianas terapéuticas Validación de dianas Colecciones de compuestos Moléculas sintéticas o naturales? Síntesis combinatoria Diseño racional Screening virtual Diseño de fármacos basado en fragmentos (fragments-based drug design o FBDD)
7 Índice Fármacos basados en RNA mensajero Screening de las colecciones de compuestos Screening in vitro Screening in vivo: estrategias emergentes alternativas o complementarias al HTS Hits y leads Del hit al lead Optimización de leads Del candidato a fármaco al medicamento Introducción Estudios preclínicos Desarrollo de la formulación Ensayos clínicos Registro Farmacovigilancia (Fase IV de los ensayos clínicos) Bibliografía Preguntas de repaso Bases moleculares de la biocatálisis aplicada y biotransformaciones. Preparación y optimización de un biocatalizador dentro del marco de la biotecnología farmacéutica La biocatálisis dentro del marco de la biotecnología farmacéutica Introducción Ventajas e inconvenientes de la biocatálisis Selectividad en los procesos catalizados por un biocatalizador Tipos de biocatalizadores Etapas en el escalado industrial de un proceso biocatalizado por enzimas Biocatálisis y química sostenible (química verde) Producción de biocatalizadores para uso biotecnológico Búsqueda de nuevas enzimas naturales a través de screening de nuevos organismos productores de enzimas y metagenómica Obtención de enzimas mediante mutagénesis y evolución dirigida de enzimas Diseño de novo, enzimas a la carta Inmovilización de enzimas Ventajas e inconvenientes en la inmovilización de enzimas Métodos de inmovilización de enzimas Elección del método de inmovilización de enzimas Ingeniería del medio de reacción Enzimas en medios no convencionales
8 Fundamentos prácticos de tecnología farmacéutica Enzimas en disolventes neotéricos Bibliografía Preguntas de repaso Ejemplos de utilización de biocatalizadores en procesos de preparación de moléculas bioactivas de interés farmacológico Introducción Empleo de biocatalizadores en procesos de preparación de moléculas bioactivas de interés farmacológico Oxidorreductasas (EC 1) Transferasas (EC 2) Hidrolasas (EC 3) Bibliografía Preguntas de repaso Biotecnología Vegetal. Cultivos vegetales in vitro. Obtención de productos de interés farmacéutico Biotecnología Vegetal: cultivos vegetales in vitro Producción de metabolitos secundarios Metabolitos secundarios de interés farmacéutico en cultivos in vitro Ventajas del cultivo in vitro frente a los sistemas tradicionales de producción Bibliografía Preguntas de repaso Biotecnología Vegetal. Optimización de la producción de metabolitos secundarios de interés farmacéutico en cultivos in vitro Producción industrial de metabolitos secundarios: procedimientos Obtención de explantos y selección de líneas celulares productivas Optimización de las condiciones de cultivo para la producción de metabolitos secundarios Adición de precursores Tipos de cultivos para la producción industrial de metabolitos secundarios Elicitación Biotransformaciones o bioconversiones Sistemas de producción a gran escala de metabolitos secundarios: biorreactores
9 Índice Transformaciones genéticas Perspectivas de la Biotecnología Vegetal en el ámbito de la salud Bibliografía Preguntas de repaso Aspectos básicos de la manipulación in vitro de células de mamífero Cultivo celular: definición, ventajas e inconvenientes de los cultivos celulares y sus aplicaciones Definición de cultivo celular Ventajas e inconvenientes de los cultivos celulares Aplicaciones de los cultivos celulares Elementos necesarios para un laboratorio de cultivos de células de mamífero Contaminaciones Agentes químicos Agentes biológicos Ambiente estéril Utilización de material aséptico Evitar la posibilidad de accidentes Ambiente de cultivo Fase gaseosa Propiedades físicas Medios de cultivo y suplementos Sustratos Tipos de cultivo Tipos de cultivos celulares Cultivos bidimensionales y tridimensionales Bibliografía Preguntas de repaso Aplicaciones biotecnológicas del cultivo in vitro de células de mamífero Obtención de productos de interés farmacológico e industrial Ejemplo de aplicación biotecnológica: producción de α-1,4-glucosidasa (Myozyme) para el tratamiento de la enfermedad de Pompe Ingeniería tisular. Bioingeniería de órganos Búsqueda de dianas y nuevos fármacos
10 Fundamentos prácticos de tecnología farmacéutica Ejemplo de proceso de búsqueda de nuevos fármacos: fármacos antitumorales de origen marino desarrollados por PharmaMar Ensayos de toxicidad de fármacos y otros compuestos en cultivos de células de mamífero Terapia génica celular Reprogramación celular a partir de células somáticas: células ips Retos de la terapia celular y de los modelos de enfermedad Bibliografía Preguntas de repaso
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