Acción de la enzima de restricción EcoRI

Transcripción

1 Acción de la enzima de restricción EcoRI S Lobos C - U de Chile 1

2 S Lobos C - U de Chile 2

3 S Lobos C - U de Chile 3

4 Nucleic Acids Res September 15; 29(18): Structure and function of type II restriction endonucleases S Lobos C - U de Chile 4

5 Endonucleasas de restricción Tipo II S Lobos C - U de Chile 5

6 Endonucleasas de restricción Tipo II S Lobos C - U de Chile 6

7 Eco RI: Model image of the restriction enzyme ECO RI (red and yellow) binding to DNA S Lobos C - U de Chile (blue). The enzyme is made up of two symmetrical units that correspond to the double helix structure of DNA. 7

8 Frecuencias de corte por ER (en un DNA 50 %GC) La mayoría de las ER reconocen secuencias de entre 4 y 6 pb. La probabilidad que se encuentre una secuencia de 4 nt en el DNA es: ([1/4] 4 ) = 1 en 256 pb. Una secuencia de 6 nt = ([1/4] 6 ) = 1 en pb. Otras ER reconocen secuencias más largas (hasta 8 pb). Un sitio de reconocimiento de 8 pb ocurrirá con una frecuencia de aproximadamente 1 en bases ([1/4] 8 ). Ej. NotI 8

9 Frecuencias de corte en ER s Corte Frecuente Sitio Corte Infrecuente Sitio Sau3AI GATC\ EcoRI G\AATTC TaqI T\CGA NotI GC\GGCCGC HaeIII GG\CC BamHI G\GATCC Nt.CviPII \CCD BcgI CGANNNNNN\TGC S Lobos C - U de Chile 9

10 Ligación de fragmentos de restricción con extremos cohesivos v/s Ligación de extremos romos DNA I + DNA II T 4 DNA ligasa ATP DNA recombinante S Lobos C - U de Chile 10

11 S Lobos C - U de Chile 11

12 Otros enzimas Metilasas Nucleasas Fosfatasas Polimerasas Transcriptasa inversa S Lobos C - U de Chile 12

13 DNA pol I de E. coli Fragmento Klenow Klenow H and Henningsen I "Selective Elimination of the Exonuclease Activity of the Deoxyribonucleic Acid Polymerase from Escherichia coli B by Limited Proteolysis" Proc Natl Acad Sci vol. 65 pp. 168 (1970). 13

14 Usos de DNA polimerasa I de E. coli Síntesis de DNA de doble hebra desde moldes de DNA de hebra simple Rellenado de extremos 3 recesivos de fragmentos de DNA Digestión de extremos 3 protuberantes Preparación de sondas de DNA radiactivas 14

15 Usos del fragmento Klenow de la DNA pol I de E. coli A. Relleno de extremos 3 recesivos para generar extremos romos B. Degradacion de extremos 3 protuberantes, t para generar extremos romos 5-3 DNA polimerasa en presencia de dntp y F. Klenow 3-5 exonucleasa de la DNA pol Klenow AATT-OH 15

16 Marcación de DNA por iniciación al azar (random priming) Nucleótidos radiactivos Hexámeros 1 y 2: partidores M: hebra templado (hebra simple) P: polimerasa N: hebra recien sintetizada 16

17 Marcación por traslado del nick (Nick translation) 17

18 DNA polimerasa Taq Uso en PCR Original de bacteria termófilathermus aquaticus Termo-resistente, activa a altas temperaturas Carece de actividad 3-5 exonucleasa (mayor frecuencia de errores en la polimerización: : 1 en 1000 a 1 en pb) Otras termoestables con actividad 3-5 exo se usan para amplificación de secuencias que se requiere preservar de mutaciones (Pfu, Vent DNA pol, Tli, etc) 18

19 Síntesis de cdna por Transcriptasa inversa 19

20 20

21 T7 o T4 RNA polimerasas Oi Origen viral: de fagos T7 o T4 Síntesis de RNA usando DNA como templado. Requiere un promotor compatible. Uso en la transcripción in vitro de genes de interés. En construcción de sistemas de expresión recombinante. 21

22 Usos de T7 RNA polimerasa 22

23 Nucleasas Desoxirribonucleasas (DNasas), sustrato es DNA Ribonucleasas (RNasas), sustrato en RNA Endonucleasas y exonucleasas Mas usadas son: DNasa I (endonucleasa) Eliminar DNA de preparaciones de RNA o de proteínas. Estudio de interacción DNA-proteína por DNasa footprinting. RNasa A (endo-ribonucleasa) RNasa A (endo ribonucleasa) Eliminar RNA de preparaciones de DNA. Las dos son originales de páncreas de bovino. 23

24 Exonucleasa III Remoción de nucleotidos, uno a uno, desde el ext. 3 OH. ExoIII E ataca el 3' OH en DNA doble hebra con extremo romo o extremo 5 protuberante. ExoIII ExoIII Ejemplo de aplicación de ExoIII en la generación de mutaciones por deleción en un promotor. 24

25 DNA ligasas T4 DNA ligasa ATP catalizan la formación de un enlace fosfodiéster entre un extremo 3 OH y un 5 PO 4 T4 DNA ligasa. Aplicacion en la formación de moléculas de DNA recombinante. Liga fragmentos cohesivos (complementarios) y romos, aunque éstos últimos son menos favorecidos. Extremo fosfato en C 5 es fundamental. ATP como cofactor 25

26 Fosfatasa alcalina de intestino de ternera (CIP) Aplicación: desfosforilación de extremos 5 P para evitar autoligación, en clonamiento de DNA. 26

27 T4 Polinucleótido quinasa (PNK) Aplicaciones 1. Marcación de ácidos nucleicos (RNA y DNA) en el extremo 5 por fosforilación con γ 32 P-ATP 2. Fosforilación de oligonucleótidos sintéticos en el extremo 5 27

28 Electroforesis en gel de DNA Método analítico de visualización del DNA basado en la migración del DNA a través de un gel Gel Polímero de agarosa Polímero de acrilamida o poliacrilamida il V = q E / f V= velocidad de migración E= gradiente de potencial eléctrico (Volts/cm) q= carga eléctrica efectiva de la partícula f= coeficiente de fricción (tamaño y forma) S Lobos C - U de Chile 28

29 Gel electrophoresis of DNA S Lobos C - U de Chile 29