Preguntas esenciales. Tecnología del DNA recombinante, clonación y creación de genes quiméricos

Transcripción

1 reguntas esenciales Tecnología del DA recombinante, clonación y creación de genes quiméricos 1. Se pueden crear nuevos genes usando DA recombinante? 2. Se puede modificar la herencia de un organismo usando DA recombinante? 3. Cuales son los métodos que usan los científicos para crear moléculas de DA recombinantes? Qué significa Clonar? Qué es una librería o genoteca de DA? Se puede amplificar DA sin usar un organismo vivo? Es posible hacer cambios dirigidos en la herencia de un organismo? ero primero vamos a recordar un poco Un gen típico eucariota! ROMOTOR GE intrón 1 intrón 2 exón 1 exón 2 exón 3 + (hebra sentido) U (sólo RA) C T pirimidinas G A purinas DA hace RA hace ROTEIA + (hebra sentido) ROMOTOR GE + cadena ROMOTOR GE intron 1 intron 2 exon 1 exon 2 exon 3 intron 1 intron 2 exón 1 exón 2 exón 3 RApol re-mra RApol La complementaria de una cadena negativa se sintetiza para producir la copia de un gen: TRASCRICIÓ 1

2 RApol re-mra proteína H 2 mra TRADUCCIÓ Splicing o ayuxtamiento mra M S G RA Ribosomal mra t RA OBJETIVOS Qué significa clonar? Clon: una colección de moleculas o células, todos idénticos a una molécula o célula original Clonar un gen es hacer copias del mismo, por ejemplo en una población bacteriana 1. CLOAR Gen puede ser una copia de un gen original o natural Gen puede ser una versión alterada del mismo Tecnología del DA recombinante lo hace posible en el laboratorio GE CLO = multiples copias de la misma cosa or tanto si clonamos un gen, significa: intron 1 intron 2 exon 1 exon 2 exon 3 restricción Cortarlo (RESTRICCIÓ) del resto del genoma Unirlo covalentemente (LIGARLO) dentro de algo que se propague (un VECTOR). Situar el vector dentro (TRASFORMARLO) de una célula (HUESED) que va a propagar el vector por nosotros VECTOR or ejemplo plasmid ligar Vector recombinante 2

3 ROAGACIÓ DEL VECTOR Cromosoma del huesped Vector recombinante TRASFORMAR roliferación celular Incremento del número de copias del plásmido bacteria Recuerda DA procariota no tiene intrones! Si queremos trabajar con un gen y su producto necesitamos un versión sin intrones del gen: re-mra splicing RApol mra ecesitamos hacer una versión en DA del mra Su nombre es cda Esto es: equivalente al RA mra Cuando por ejemplo decimos que hemos clonado y expresado el gen para (por ejemplo hormona de crecimiento humana) queremos decir que hemos clonado el cda de la hormona de crecimiento humana Figure Figure

4 Objetivos 1. Clonación Enzimas usadas en tecnología del DA recombinante 2. Enzimas empleados en tecnología del DA recombinante 1. DA polimerasas Reacción general: (dm) n + dt (dm) n+1 + i DApol + Todas las DA polimerasas: ecesitan un cebador con un OH libre El DA sintetizado en la nueva hebra SIEMRE va en dirección OH OH OH OH Equivalente a nuestra hebra para nuestro gen ejemplo.e. DA polimerasa I de E. coli. DA polimerasa dependiente de DA.e. DA polimerasa I de E. coli. DA polimerasa dependiente de DA 4

5 .e. DA polimerasa I de E. coli. DA polimerasa dependiente de DA.e. DA polimerasa I de E. coli. DA polimerasa dependiente de DA ero también tiene otras actividades asociadas p.e. exonucleasa (eliminar los cebadores RA primers en la replicación del DA) ero también tiene otras actividades asociadas p.e. exonucleasa (eliminar los cebadores RA primers en la replicación del DA).e. DA polimerasa I de E. coli. DA polimerasa dependiente de DA.e. DA polimerasa I de E. coli. DA polimerasa dependiente de DA ero también tiene otras actividades asociadas p.e. exonucleasa (eliminar los cebadores RA primers en la replicación del DA) ero también tiene otras actividades asociadas p.e. exonucleasa (corrige errores cometidos por la polimerasa) 2. RA polimerasas En el lab - del Bacteriofago - RA polimerasa dependiente de DA reacción general: (M) n + T (M) n+1 + i Alta especificidad para promotores o requiere un cebador RApol ROMOTOR GE promotor (re)- mra RA se sintetiza en dirección 5

6 3. Transcriptasas reversas DA polimerasa dependiente de RA se encuentran en virus (AMW avian myeloblastosis virus / MMLV moloney murine leukemia virus. Algunas transcriptasas reversas también tienen y/o actividad exorase (degrada RA después de la transcripción reversa) Requieren un cebador 3. Transcriptasas reversas DA polimerasa dependiente de RA se encuentran en virus (AMW avian myeloblastosis virus / MMLV moloney murine leukemia virus. Algunas transcriptasas reversas también tienen y/o actividad exorase (degrada RA después de la transcripción reversa) Requieren un cebador RA cebador RA 3. Transcriptasas reversas DA polimerasa dependiente de RA se encuentran en virus (AMW avian myeloblastosis virus / MMLV moloney murine leukemia virus. Algunas transcriptasas reversas también tienen y/o actividad exorase (degrada RA después de la transcripción reversa) Requieren un cebador 4. Endonucleasas de restricción Sólo se usan tipo 2 en DA recombinante Reconoce secuencias palíndromes Cortan dentro endo - DA cebador RA DA (de nuevo) se sintetiza en dirección 4. Endonucleasas de restricción Sólo se usan tipo 2 en DA recombinante Reconoce secuencias palíndromes Cortan dentro endo - DA 5. Ligasa Corrige a la endonucleasa de restricción y requiere AT Recuerda se requieren extremos compatibles Funciona mejor en extremos cohesivos que en romos 6

7 DA Ligasa G -AATTC AT /Mg 2+ GAATTC + CTTAA- G CTTAAG Ligación de extremos romos usando T4 DA ligasa, que cataliza la unión dependiente de AT de moléculas de DA 6. Quinasas / Fosfatasas _ A OH OH AT HO DA o RA Como se hace un cda? Transcriptasa reversa: encontrada en virus requiere un cebador mra tiene una cola polia Fosfatasa (elimina grupos ) p.e. fosfatasa de tracto intestinal mra HO DA or RA TTTTTTT mra Transcriptasa reversa + dts Oligo dt I.e (TTTTTTTTT) TTTTTTT TTTTTTT 7

8 1 era cadena del cda TTTTTTT DA de Doble Cadena, con una cadena equivalente al mra TTTTTTT AAAAAA DA polimerasa + dts 1 ra cadena del cda TTTTTTT AAAAAA 2 nda cadena de cda VECTOR ligar cebador or ejemplo plasmido Endonucleasas de restricción (E DETALLE) Se encuentran en bacterias..e. BamHI Bacillus amyloliquefaciens cepa H En naturaleza funciona para digerir DA extraño en la bacteria Reconoce (secuencias palíndromes) secuencias inversas repetidas (tiene la misma secuencia - en cada cadena) restringe la existencia en la bacteria ara evitar daño del DA endógeno, los sitios de restricción están metilados = secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de restricción Cromosola propio or ejemplo: bacteriófago_ Tipos de endonucleasas Tipo I: Dependiente de AT Endonucleasa y metilasa Digiere DA en sitios al azar Hasta 1 kb del sitio de reconocimiento Tipo II: Independiente de AT Endonucleasa Digiere DA en el sitio de reconocimiento Type III: dependiente de AT Endonucleasa y metilasa Digiere DA ~ 25nts de secuencia de reconocimiento Endonucleasas de restricción hidroliza entre el OH y para dejar un grupo en el final : EcoR1 + H 2 O G A C A T T T T A C A G-OH G GAATTC CTTAAG + H 2 O Cadena - -AATTC CTTAA- OH-G Cadena + 8

9 Enzimas de restricción Hay varios cientos de endonucleasas de restricción disponibles que producen varios finales : protuberantes.e. protuberantes.e. HhaI Romos.e. SmaI GAATTC CTTAAG G -AATTC CTTAA- G GCGC CGCG GCG C- CCCGGG GGGCCC CCC -GGG GGG- CCC reconoce una secuencia de DA de doble cadena específica y corta dentro de esa secuencia romo Se llama el sitio de reconocimiento normalmente 4-8 nucleó nucleótidos Corta fragmentos largos de DA en piezas Llamada digestió digestión de restricció restricción -C GCG Los cortes producidos por las enzimas de restricció restricción tienen simetrí simetría Corta de manera reproducible Se encuentran en bacteria roducen dos tipos de finales cohesivos o romos Enzimas de restricció restricción hace cortes que se superponen porque reconocen normalmente secuencias simétricas Llamadas alí alíndromes Inverted alindrome: alíndrome: la lectura de bases en una cadena en is la misma que la secuencia de la secuencia complementaria Extremos cohesivos: cohesivos: cada fragmento de DA (independientemente de la fuente del DA) generado al cortar un DA con el mismo E.R. tiene la misma secuencia de bases en los dos finales digeridos (leídos en dirección a ). El nú número de pares de bases en el sitio del enzima de restricció restricción determina la distancia media entre sitios de restricció restricción Los dos fragmentos de DA distintos se pueden unir por complementareidad de bases para formar una molécula de DA recombinante Molé Molécula de DA recombinante: recombinante creación de una nueva combinación de DA no encontrada en la naturaleza GTAC Es decir la distancia media entre sitios producidos por E.R. = 4 n donde n = número de bases en el sitio kb or kilobase = 1000 pares de bases 9

10 Se pueden usar algunos trucos para crear sitios de restricción De manera práctica digestión con endonucleasas de restricción del DA del fago lambda Lambda un virus que infecta bacteria Genoma linear de DA de doble cadena de ~ 49Kb Sitio RE lamda genome plasmid Electroforesis en gel de agarosa lamda genome lambda lambda plasmid plasmid +RE +RE RE plasmid RE Tamaño del DA Con el fin de introducir DA en un vector necesitamos extremos compatibles Usar 2 (no-compatibles) enzimas de restricción: BamHI BamHI + BamHI VECTOR VECTOR BamHI.e. plasmido.e. plasmido + BamHI ligar BamHI ligar roblema: Autoligación del vector >> recombinantes BamHI 10