Tecnología de ADN recombinante. Técnicas fundamentales: - Restricción - Clonado - Hibridización -PCR

Transcripción

1 Tecnología de ADN recombinante Técnicas fundamentales: - Restricción - Clonado - Hibridización -PCR 1

2 Bibliotecas de ADN = Genotecas = bancos de secuencias = libraries colección de clones celulares (bacterias, levaduras, etc) en las que cada célula contiene un fragmento de ADN recombinando en un vector Genotecas de ADN genómico: contiene al menos una copia de las secuencias contenidas en el genoma, en forma estable y en un número manejable de clones. Genotecas de ADN copia (o ADN complementario): contiene todos los ARNm bajo la forma de ADNc en un tipo celular dado y en un momento determinado de la vida celular, en forma estable y en un número manejable de clones. Estrategia a seguir: Se aíslan todas las secuencias en sistemas independientes Se amplifican Se seleccionan e identifican Requerimientos generales: Eficiencia Estabilidad Cobertura 2

3 Objetivos de estudio con cada tipo de biblioteca: - Genotecas de ADNc: - Análisis de estructura y función de secuencias exónicas, deducción de secuencias proteicas. - Obtención de sondas de ADNc - Identificación de genes que se expresan en un determinado tipo o estadío celular. - Producción de proteínas eucariotas en bacterias - Genotecas de ADNg: - Análisis de estructura y función de genes (intrones, exones, secuencias regulatorias), regiones intergénicas, etc. - Obtención de sondas de ADNg - Organización del genoma 3

4 Ventajas y desventajas de la construcción de cada tipo de genoteca: Genotecas de ADNc ventajas - tamaño pequeño - enriquecidas en secuencias según la expresión desventajas -fácil degradación del ARNm - sólo se pueden analizar secuencias codificantes - es difícil identificar secuencias de muy bajo nivel de expresión Genotecas de ADNg ventajas - están representadas todas las secuencias del genoma desventajas - construcción laboriosa - no todos los clones pueden expresarse en procariotas 4

5 Tamaño de la genoteca Número mínimo de clones requeridos para representar todo el genoma de un organismo al menos una vez Depende de: - tamaño de los fragmentos clonados - tamaño del genoma a clonar Organismo Tamaño genoma haploide Nº insertos de 15 Kb Nº insertos de 35 Kb E. coli 4,2x10 6 1,3x10 3 5,5x10 2 S. cerevisiae 1,4x10 7 2,9x10 3 1,1x10 3 D. melanogaster 1,4x10 8 4,3x10 4 1,8x10 4 H. sapiens 3,3x10 9 1,0x10 6 4,3x10 5 5

6 N = ln (1-p) ln(1-x/y) N: número de clones a analizar (tamaño de la genoteca) p: probabilidad de encontrar un una secuencia determinada x: tamaño del inserto y: tamaño del genoma Consideraciones prácticas: - No todos los clones están igualmente representados - Pérdida de clones durante el almacenamiento y/o amplificación - Pérdida de clones por competencia en medio líquido o sólido - Dado que los fragmentos en una población son clonados al azar, hay un 50% de probabilidad de encontrar un gen de copia única. El tamaño de la biblioteca debe ser entre 3 y 10 veces el tamaño del genoma a secuenciar. 6

7 Elección del vector de clonado - Depende del objetivo,del tipo de genoteca y del tamaño del inserto Plásmidos hasta 10 Kpb Fagos λ Kpb Cósmidos Kpb Fagos P Kpb BAC Kpb YAC hasta Con insertos chicos: - Fácil manejo - Transformación de bacterias - Número alto de clones - Con insertos grandes: - Menor número de clones a manipular - Transformación difícil - Menor número de copias - Crecimiento lento 7

8 Preparación del inserto ADN genómico: - Fragmentación mecánica - Restricción parcial - Separación por tamaño ADN copia: - Purificación de ARNm por unión a polit - Síntesis de ADNc (primers oligo dt o al azar) - Separación por tamaño 8

9 Selección de clones Identificación de aquellos clones que han incorporado el vector, contengan o no el inserto que se quería clonar. Plásmidos resistencia a antibióticos Rastreo de clones recombinantes Identificación entre los clones seleccionados, de aquellos que contienen el inserto de interés Hibridización Expresión Actividad PCR Restricción 9

10 Esquema general de rastreo de colonias por hibridización Réplica en un disco de nitrocelulosa Colonias sobrevivientes de la selección - Lisis de células - Desnaturalización del ADN - Fijación del ADN Hibridización con sonda 32 P-ADN o 32 P-ARN Exposición sobre una Película de rayos X 10