EXPRESION EN BACTERIAS DE LOS COMPONENTES CATALlTlCOS DE LA PIRUVATO DESHIDROGENASA DE MAMIFEROS

Transcripción

1 EXPRESION EN BACTERIAS DE LOS COMPONENTES CATALlTlCOS DE LA PIRUVATO DESHIDROGENASA DE MAMIFEROS El reciclaje de la glucosa (el ciclo de Cori) representa una constante en el metabolismo de los carbohidratos sea cual sea el estado metabólico considerado: alimentación, ayuno, ejercicio o diabetes. A nivel enzimático, el reciclaje depende, entre otros factores, de la regulación del complejo de la piruvato deshidrogenasa, de forma que una proporción de lactato, piruvato y alanina, producidos en tejidos extrahepáticos, escape a su oxidación y pueda ser convertida en glucosa en el hígado. La actividad de la piruvato deshidrogenasa es un factor clave determinante de la oxidación de la glucosa en tejidos bien oxigenados. En los animales, la piruvato deshidrogenasa constituye un complejo multienzimático de localización mitocondrial. Este complejo cataliza la descarboxilación oxidativa del piruvato con formación de acetil-coa, CO, y NADH mediante un proceso esencialmente irreversible. La regulación de la reacción es esencial para la conservación del piruvato, precursor de la glucosa, en los animales que carecen de cualquier otra reacción que pueda conducir a la síntesis de la misma a partir del acetil-coa. Este complejo multienzimático tiene asimismo un papel importante en la producción de ATP y en la biosíntesis de ácidos grasos e intermediarios del ciclo oxidativo tricarboxílico a partir de glucosa. El complejo posee, al menos, tres componentes catalíticos, El, E2, E3 y dos componentes de un sistema de regulación por interconversión covalente por fosforilación 1 defosforilación. Existen otros complejos multienzimáticos de estructura muy parecida en el metabolismo energético: cetoglutarato dishidrogenasa y la deshidrogenasa de aminoácidos ramificados. Ocupan asimismo posiciones claves en el metabolismo intermediario, se localizan también en la mitocondria y se encuentran sometidos a regulación hormonal y alimenticia (YEA- MAN, S. J.: Biochem J., 257, 625). Cada complejo posee dos componentes específicos: El y E2, mientras el tercer componente, dihidrolipoamida deshidrogenasa es común a los tres complejos. Al tratarse de complejos multienzimáticos de difícil manipulación, las técnicas convencionales de enzimología y estudio del metabolismo no habían logrado sustanciales avances en la comprensión de la organización estructural y funcional de dichos complejos. Es por esto que el abordaje del estudio de estos complejos mediante la tecnología del DNA recombinante ha abierto nuevas perspectivas hasta ahora impensables y ha permitido el diseño de experimentos encaminados a clarificar aspectos fundamentales de su funcionamiento. El primer paso, el aislamiento, clonaje y secuenciación del los RNA mensajeros de los diversos componentes catalíticos de estos complejos se ha obtenido en los últimos tres años. Se está, pues, actualmente, en una inmejorable disposición para empezar a clarificar todos aquellos aspectos de relación estructura/función de dichos complejos multienzimáticos. Dado que en nuestro laboratorio disponemos de clones correspondientes de los cdnas complejos de los diferentes componentes catalíticos de la piruvato deshidrogenasa, hemos decidido abordar la expresión de los mismos en sistemas bacterianos que nos permiten su manipulación "in vitro" con objeto de comprender el funcionamiento de estos componentes y de la piruvato deshidrogenasa. En esta comunicación presentamos la expresión del primer componente, piruvato descarboxilasa, en un sistema especial de expresión que utiliza una cepa bacteriana de E. Coli artificialmente diseñada para tal fin. La expresión de un gen de mamífero en

2 comercial. Los controles pertinentes demostraron que la inducción del vector solo sin la presencia del gen de mamífero no producía la aparción de esta nueva proteína. Lo que sí se observa es una expresión basal del gen de mamífero antes de añadir IPTG. Ello se debe, probablemente, a una cierta capacidad por parte de la RNA polimerasa intrínseca de E.Coli para reconocer al promotor acoplado el gen de mamífero. En cualquier caso, la figura muestra nítidamente cómo al inducir con IPTG, la nueva proteína expresada llega a constituir el componente mayoritariamente expresado en el extracto. La figura 28 también muestra la confirmación definitiva de que la proteína expresada es efectivamente uno de los componentes de la piruvato deshidrogenasa de mamífero. Cuando se realiza un experimento de "Western-blot", se obseva que un anticuerpo específico frente a la piruvato deshidrogenasa de mamífero, reconoce exclusivamente al componente recién expresado, existiendo por tanto una doble identificación, por peso molecular y por reconocimiento inrnunológico. Parece pues claro que se ha obtenido una potente expresión en bacterias de un gen de mamífero correspondiente a una enzima clave del metabolismo energético. En resumen, la puesta a punto de este tipo de metodología va a permitirnos estudiar y analizar todas aquellas características estructurales implicadas en la función enzimática del componente catalítico El de la piruvato deshidrogenasa. Todo ello puede incluso permitir en un futuro la manipulación de partes de este complejo con objeto de crear artificialmente enzimas con nuevas eficacias enzimáticas. GABRIEL PONS Y PILAR RUlZ Unidad de Bioquímica Facultad de Medicina Universitat de Barcelona

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4 una bacteria implica una serie de requisitos: en primer lugar utilizar copias de cdna que represente el RNA mensajero maduro, dado que la bacteria carece de sistemas de procesamiento. En segundo lugar, es necesario que las zonas de secuencia previas al inicio de la transcripción y traducción y las de la finalización de dichos procesos sean reconocidas por los sistemas bacterianos, distintos de los que operan en eucariotas. En tercer lugar, debe acoplarse el cdna un promotor específicamente reconocido por las RNA polimerasas procariotas con objeto de lograr una potente expresión del gen objeto de nuestro estudio. Finalmente, y en cuarto lugar, necesitamos un sistema que nos permita la detección y el seguimiento de la expresión de dicho gen en los estractos bacterianos. De acuerdo con estas premisas el abor- daje experimental y los resultados obtenidos se describen a continuación: 1.) Preparación del cdna de la subunidad catalítica de la piruvato deshidrogenasa: Dado que se trata de una enzima de localización mitocondrial, se procedió a la eliminación de la zona que codificaba para el péptido señal de localización mitocondrial. Asimismo se realizaron las manipulaciones necesarias para asegurar que el cdna podría ser correctamente expresado en las bacterias. 2.) Introducción del cdna en el vector de expresión: la figura 1 recoge esquemáticamente el funcionamiento del sistema de expresión utilizado. El gen que se desea expresar es subclonado en un vector plasmídico junto a un promotor muy potente reconocido específica y exclusivamente por la RNA polimerasa del bacteriofago T7. Figura 7. Esquema del sistema de expresión utilizado La figura muestra una cepa bacteriana (BL21 DE3) que contienen el gen de la RNA polimerasa del fago T7 bajo el control del promotor Lac. Esta cepa ha sido transformada con el plásmido pet8c-e1a que posee el cdna complemento de una subunidad de la piruvato deshidrogenasa de mamífero bajo control de un promotor sensible a la RNA polimerasa del fago TZ

5 El plásmido conteniendo esta construcción es introducido en un cepa bacteriana cuyo cromosoma contiene el gen de la RNA polimerasa del bacteriófago T7. Este gen, además, está controlado por el promotor del operón Lac de la P-galactosidasa, fuertemente inducible por moléculas como IPTG (isopropiltiogalactosa). El sistema actúa en consecuencia de la siguiente forma: se incuban las células bacterianas en condiciones de crecimiento óptimo hasta llegar a una zona intermedia del crecimiento logarítmico. Es entonces cuando se añade el inductor IPTG que promueve la expresión potente de la RNA polimerasa T7, la cual a su vez, entonces, reconoce específicamente al promotor acoplado al gen que queremos expresar. Ello conduce a una expresión potente del gen introducido, dada la tremenda especificidad de dicha polimerasa. Tomando muestras del cultivo bacteriano a tiempos sucesivos y realizando una electroforesis de las proteínas presentes en el extracto, puede detectarse claramente la aparición de una nueva proteína. La figura 2A recoge el experimento realizado con la subunidad catalítica de la piruvato deshidrogenasa. Se observa claramento como a medida que progresa el tiempo de inducción con IPTG va apareciendo una nueva banda de proteína que por peso molecular, coincide con la subunidad El a del estándard de piruvato deshidrogeriasa Figura 2. Expresión de la subunidad E1A de la piruvato deshidrogenasa de mamífero en un sistema de expresión bacteriano. A. Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS de diversos extractos proteicos. Carriles 1 y 2: Plásmido control sin cdna Carriles 3-7: Plásmido conteniendo el cdna a tiempos crecientes de incuvación con IPTG. B. Experimento de "Western-Blot" de las mismas muestras utilizando un antisuero específico frente a piruvato deshidrogenasa total de mamífero.