Ingeniería Genética I 2015

Transcripción

1 Ingeniería Genética I 2015

2 Repasemos: Plásmidos Cómo se aislaban y transferían por transfección en los 80?

3 ligasa Cómo se clonaba en los 80?

4 Se producirían 4 tipos de células que tenemos que separar físicamente entre sí: a) Varios plásmidos en = célula b) Sin plásmido c) No recombinantes d) Recombinantes conteniendo el gen de interés e) Recombinantes con solo UN plásmido recombinante, pero con otros segmentos de DNA que NO contienen el gen de interés (c) (d + e) (b)

5 a) Varios plásmidos en = célula? Por dilución (pocos plásmidos y muchas bacterias) La proporción de bacterias que incorporan un plásmido es baja La proporción de bacterias que incorporan 2 o + plásmidos es ínfima Pocas moléculas Muchas células b) Sin plásmido Por selección con antibiótico (medio selectivo)

6 c) Cómo eliminar los plásmidos vacíos (no recombinantes)? Vectores plasmídicos de los 80s (pbr322)

7 Sólo se produce un tipo de plásmido recombinante? En un medio líquido no way

8 d) Muchos recombinantes distintos i) Cómo los separo entre sí?

9 d) Muchos recombinantes distintos i) Cómo los separo entre sí? PLAQUEANDO ii) Cómo aíslo el que me interesa? Varias soluciones para esto: Si no tengo información previa sobre lo que busco: Hay que clonar (repicar = aislar y cultivar separadamente = amplificar cada colonia) LIBRARY (clonoteca/genoteca)

10 Detengámonos un poco en la jerga de la ingeniería genética Qué significa aquí clonar un gen en comparación con clonar por ej. una oveja? Qué significa obtener DNA recombinante en comparación con la recombinación homóloga que ocurre durante la meiosis? Recombinación ilegítima!

11 Clonar un gen significa aislarlo y amplificarlo Qué significa el término library? Clonotecas vs genotecas

12 Cómo clono el gen que me interesa? Las primeras libraries fueron clonotecas de cdna

13 Actualmente se usan adaptadores de secuencias conocidas (seguidas o no por PCR)

14 Cómo encuentro mi gen? o cómo encontrar una aguja en un pajar (un gen entre o un segmento del orden de los miles de nucleótidos en un genoma de miles de millones)? A. Por abundancia relativa B. Por su producto de expresión: clonotecas de cdna de expresión C. Por hibridización D. Por PCR E. Por ensayos funcionales: Complementación funcional en levaduras

15 Por abundancia relativa Pura: tomando clones al azar dada la buena probabilidad (ejemplo de la insulina) o Asistida: hibridación diferencial

16 Cómo encuentro mi gen? A. Por abundancia relativa B. Por su producto de expresión: clonotecas de cdna de expresión C. Por hibridización D. Por PCR E. Por ensayos funcionales: Complementación funcional en levaduras

17 B. Si disponemos de anticuerpos, por su producto de expresión vía clonotecas de cdna de expresión y se identifica por reconocimiento antígenoanticuerpo

18 Si se dispone de anticuerpos: El producto de expresión se identifica por reconocimiento antígeno-anticuerpo

19 También podríamos producir proteína recombinante y ensayar, por ejemplo, su efecto biológico, aunque probablemente necesite ser optimizado para maximizar producción

20 Cómo encuentro mi gen? A. Por abundancia relativa B. Por su producto de expresión: clonotecas de cdna de expresión C. Por hibridización D. Por PCR E. Por ensayos funcionales: Complementación funcional en levaduras

21 Por hibridización (si contamos con fragmentos del gen o de los homólogos) Prospección/relevamiento ( screening con sondas marcadas)

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26 El resultado de un screening secundario

27 Cómo encuentro mi gen? A. Por abundancia relativa B. Por su producto de expresión: clonotecas de cdna de expresión C. Por hibridización D. Por PCR E. Por ensayos funcionales: Complementación funcional en levaduras

28 D. Diseño de iniciadores/cebadores (primers) específicos i) Si partimos de mrna Hoy en día, esta parte, se hace por PCR

29 05_02.jpg ii) Si partimos de DNA genómico

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32 Cómo encuentro mi gen? A. Por abundancia relativa B. Por su producto de expresión: clonotecas de cdna de expresión C. Por hibridización D. Por PCR E. Por ensayos funcionales: Complementación funcional en levaduras

33 Screening por complementación funcional en levaduras Saccharomyces cerevisiae es un sistema eucariota simple Fácil de cultivar y manipular genéticamente Contamos con mutantes, vectores de expresión, protocolos de transformación, etc

34 Screening por complementación funcional en levaduras Mutante de levadura deficiente en una función de interés Una clonoteca del organismo de interés en un vector apto para levaduras cdna se expresa por un promotor de levaduras, inducible

35 Screening por complementación funcional en levaduras El mutante se complementa cuando el gen se expresa

36 Ejemplo: clonado de un canal de potasio Mutante transformante Medio rico en potasio Medio no inductor Medio inductor Medio pobre en potasio

37 Necesitamos de un vector apropiado

38 Cómo clonaron por primera vez un telómero y un centrómero?

39 Cromosomas artificiales de levaduras (YAC)

40 Cómo evolucionó el clonado? Vectores Nuevos plásmidos (modificación del sitio de clonado y selección de recombinantes, combinados para más de un huésped shuttle, para grandes insertos, para expresión, por integración, suicidas) Fagos Cromosomas artificiales Libraries sin vectores (para NGS) No lo veremos en esta teórica

41 recuerdan nuestro viejo vector? c) Cómo eliminar los plásmidos vacíos (no recombinantes)? Vectores plasmídicos de los 80s (pbr322)

42 Vectores plasmídicos modernos

43 Otra forma (más moderna) de eliminar los plásmidos vacíos (no recombinantes)

44 Por qué necesitamos vectores que permitan clonar insertos grandes

45 BACmidos o BAC

46 Cromosomas artificiales de levaduras (YAC)

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48 Nuevos vectores: por integración Herramienta La recombinasa es específica de secuencia y se llama integrasa

49 Para qué sirven los plásmidos suicidas? Técnicas de reemplazo alélico = Knock out Son plásmidos capaces de replicarse normalmente en un huésped (por ejemplo una cepa de E. coli) pero no en un huésped alternativo

50 Para qué sirven los plásmidos suicidas?

51 Gen X La inserción al azar es más frecuente que reemplazo alélico por recombinación homóloga neo R resistencia a geneticina (G418) tk del virus herpes simplex convierte el análogo de T ganciclovir en un inhibidor de la replicación del ADN Para qué sirven los plásmidos suicidas? Selecc + Selecc -

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53 Nuevos vectores: por integración CcdA and CcdB, which contribute to the plasmid's high stability by post-segregational killing of plasmid-free bacteria. Like the quinolones, the CcdB protein is a poison of the DNA-topoisomerase II complexes, while CcdA acts as an antidote against CcdB

54 Vectores basados en fagos

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56 Cósmidos

57 El fago P1 como vector

58 Cómo llego del cdna al clon genómico? Marco el cdna

59 Y las genotecas ( libraries genómicas) para qué se usan? Para secuenciar genomas (otra teórica) Para clonado posicional (por ej de un QTL) Para estudiar promotores, intrones, etc. Para estudios de complementación funcional y knock out o knock down

60 ? Clonado posicional

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62 Dónde están?

63 Técnicas de evaluación funcional = knock down

64 Genomic Libraries Genotecas Se parte de ADN genómico frec. postivos indep. expresión puede contener promotores e intrones problema para expresar en sistemas heterólogos usos: análisis genómico, clonado posicional, estudios sobre promotores, etc? cdna Libraries Clonotecas Retrotranscripción del ARN Dependiente sin promotores o intrones posible expresar si se coloca promotor adecuado usos: estudios de regiones codificantes, análisis de funciones génicas

65 Vectores para clonotecas Vector Tamaño inserto comentarios Fago lambda kb (reemplazo) kb (inserción) Capacidad máxima no limita a ARNm (8kb) empaquetamiento eficiente Bueno para estudiar genes individuales En general se usa el vector de inserción Más representativo que clonotecas de plásmidos Subclonados y pasos siguientes más complicados que con clonotecas de plásmidos Plásmidos bacterianos 10-15kb Fácil de transformar E coli, pero no tan eficiente como lambda a gran escala Menos representativo que clonotecas de fagos Subclonados y pasos siguientes se simplifican

66 Vectores para genotecas Vector Tamaño inserto comentarios Fago lambda Cósmido Hasta kb kb Genoma del fago ~ 48kb empaquetamiento eficiente, puede llevar % del genoma del fago En general se usa el vector de reemplazo Brazos predigeridos se pueden comprar Bueno para estudiar genes individuales Plásmido contiene sitio cos del λ; usa el empaquetamiento de éste Se propaga en E. coli como un plásmido; Útil para subclonar insertos de YAC, BAC, PAC, etc. Fósmido Similar al cósmido Contiene sitio cos del λ y el origen de replicación del plásmido F; Bajo nro de copia, más estable

67 Vectores para genotecas Vector BAC (bacterial artificial chromosome) Bacteriofago P1 PAC (P1- derived artificial chromosome) TAC (Transformable artificial chromosome) Tamaño inserto Hasta 300 kb Promedio:100 kb Máximo cerca de 100 kb Similar al BAC Similar al P1 comentarios Plásmido conteniendo el origen de replicación del F; Una copia por bacteria Versión reducida de genoma de fago genoma de P1 de 110 kb empaquetamiento eficiente sitio PAC de reconocimiento y clivaje replicón de P1 y replicón lítico inducible sitio loxp para Cre Combinación de características de BAC y PAC Con origen P1 (copia única en E. coli) y origen Ri (copia única en Agrobacterium tumefaciens) Con los bordes del T-DNA, para transformar plantas

68 Vectores para genotecas Vector YAC (yeast artificial chromosome) Tamaño inserto kb (largo de un cromosoma de levadura) Promedio: kb comentarios Se propaga en Saccharomyces cerevisiae Elementos esenciales: centrómero; telómeros que marcan el final del cromosoma; origen de replicación que funciona durante la replicación del ADN Fue una importante herramienta para mapear genomas complejos Problemas: quimeras, inestabilidad (rearreglos)