Bloque IV. Genética. Tema 23. Ingeniería genética.

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1 Biología 2º bachillerato Bloque IV. Genética. Tema 23. Ingeniería genética. ÍNDICE 1. Técnicas de manipulación del ADN 2. Clonación 3. Ingeniería genética 4. Proyecto genoma humano 5. Impacto de la tecnología del ADN 1. TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN DEL ADN Se conoce como Ingeniería Genética el conjunto de técnicas que implican la manipulación deliberada del ADN de los seres vivos. Hoy es posible conocer la secuencia de nucleótidos de un gen, cortar y empalmar ADN de distintos seres vivos, e incluso fabricar ADN artificial. 1.1 SÍNTESIS DE ADN RECOMBINANTE Primero han de obtenerse los fragmentos (Genes) de ADN. Para esto se emplean las llamadas enzimas de restricción (E de R): son enzimas que fabrican las bacterias para defenderse de los ataques de los bacteriófagos, porque rompen el genoma del virus invasor separando sus genes. Estas enzimas reconocen las secuencias palindrómicas (se leen lo mismo de derecha a izquierda que de izquierda a derecha) que existen entre gen y gen, y rompen por ahí. Se han aislado diferentes E de R en diferentes bacterias y cada una de ellas corta el ADN por una secuencia distinta. Se han empleado con éxito en el material genético de eucariotas. Con las E de R se obtienen fragmentos de ADN que se separan por electroforesis en gel: Los diferentes trozos de ADN se desplazan en un campo eléctrico, en función de su tamaño. Una vez separados, se procede a la secuenciación de los fragmentos. Para ello se emplean mezclas de didesoxirribonucleótidos de Adenina, Guanina, Citosina y Timina, marcados, (ddatp, ddgtp, ddctp y ddttp). Un didesoxirribonucleótido es un nucleótido alterado en el C 3': No tiene OH, sino H. Y por eso aquí no se puede añadir ningún otro nucleótido. Los nucleótidos de las mezclas se aparean con los de la secuencia problema formando fragmentos complementarios de ella, pero cuando aparece un nucleótido marcado en un extremo, se Tema 23. Ingeniería genética Página 1

2 sabe cuál es el nucleótido de enfrente. Los fragmentos secuenciados deben unirse, gracias a la ADN-Ligasa, a moléculas transportadoras, que se llaman vectores: son plásmidos, genomas de virus o moléculas de ADN sintético. El conjunto ADN + vector es el ADN recombinante. Estas moléculas de ADN recombinante se introducen y se "guardan" en bacterias que los replican con el conjunto de su cromosoma, produciendo una estirpe celular que constituye una biblioteca genómica. 1.2 SÍNTESIS DE ADN COMPLEMENTARIO Se llama ADNc o complementario y se obtiene a partir de una hebra de ARNm gracias a la enzima transcriptasa inversa. La ventaja de su uso es que no contiene intrones, y todas las secuencias son codificantes, al no haber tampoco regiones reguladoras y con repeticiones. 1.3 SÍNTESIS DE ADN DE NOVO: ADN SINTÉTICO Se obtienen oligonucleótidos de ADN cuya secuencia se conoce, lo cual es útil para ciertas técnicas moleculares. Se hace mediante un proceso escalonado en el que se van añadiendo nucleótidos al extremo de la cadena en crecimiento. El extremo 3 se fija a un soporte sólido, como gel de sílice, y se añaden nucleótidos activados al extremo 5. Al final, se separa el soporte y la cadena se obtiene por centrifugación o filtración. Se utilizan máquinas llamadas sintetizadores de ADN, que producen cadenas de unos 100 nucleótidos. Si se conoce la secuencia de aa de una proteína se puede sintetizar el ADN del gen correspondiente. 1.4 HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS Si nos interesa hacer varias copias de un gen lo primero que necesitamos en localizar el cromosoma y el locus que ocupa, además de saber en qué células la expresión de ese gen está activada. Para ello se emplean técnicas de hibridación, basadas en la capacidad de apareamiento entre cadenas de ácidos nucleicos con secuencias complementarias. Cuanto mayor sea el grado de hibridación mayor es la semejanza (recordad que esta técnica se emplea en estudios filogenéticos). Se necesita una sonda o molécula de ácido nucleico monocatenario y se puede hacer: Hibridación ADN-ADN. Hibridación ADN-ARN. Tema 23. Ingeniería genética Página 2

3 1.5 REACCIÓN EN CADENA DE LA ADN POLIMERASA Generalmente hay muy poca cantidad de muestras de ADN. Desde 1985 se viene desarrollando la técnica de la PCR (Reacción en cadena de la polimerasa, polymerase chain reaction) que, a partir de la capacidad de la ADN polimerasa para replicar el ADN, permite obtener múltiples copias de un determinado fragmento. La molécula que se desea replicar se desnaturaliza sometiendo el fragmento a altas temperaturas y cada una de las hebras sirve de molde para sintetizar otra cadena complementaria. Esto es un ciclo de síntesis y el proceso es exponencial: tras 20 ciclos se pueden obtener un millón de copias de una molécula de ADN. Las polimerasas empleadas en esta técnica, hoy totalmente automatizada, proceden de bacterias termófilas que tienen un crecimiento y desarrollo óptimos a temperaturas superiores a los 60 C. 2. CLONACIÓN Un clon de genes es un conjunto de copias idénticas de un gen concreto. La clonación sigue los pasos de las técnicas de manipulación del ADN (localización del gen en el cromosoma, aislamiento por E de R, unión al vector y réplica para introducirlo en la célula hospedadora). Una vez instalado en la célula hay que comprobar que se expresa. Las células hospedadoras pueden ser bacterias o células eucarióticas (animales, vegetales, levaduras) 2.1 CLONACIÓN EN BACTERIAS Los vectores son plásmidos o virus con respuesta lisogénica (el virus integra su ADN en el cromosoma bacteriano y la bacteria lo replica como si fuera propio). A veces se utilizan también cromosomas bacterianos artificiales, que son plásmidos muy grandes con marcadores, que suelen ser genes resistentes a antibióticos para detectar fácilmente las bacterias que los llevan (al emplear los antibióticos contra ellas, las que no mueren). Los conjuntos ADN-vector se introducen por transformación (esto es algo que las bacterias hacen normalmente: captar moléculas de ADN del medio) o por transducción (utilizando bacteriófagos). Tema 23. Ingeniería genética Página 3

4 Cuando se introduce un gen + vector en un cultivo de bacterias no todas lo incorporan. Hay que seleccionar las que sí y entre éstas, aquellas en las que el gen se exprese. Esto se averigua con los marcadores citados antes o con una sonda radioactiva: es una cadena de ADN marcada radiactivamente, complementaria de una de las hebras del gen clonado. 2.2 CLONACIÓN EN CÉLULAS EUCARIÓTICAS Cuando el gen se instala en células reproductoras o embrionarias sin diferenciar, este gen estará presente en todas las células del organismo, que por eso se le llama transgénico (con genes de otros, genes ajenos). Si por el contrario, el gen se introduce en un tipo concreto de células somáticas sólo aparecerá en un tejido o en un órgano. Esto es lo que se hace en terapia génica. El gen se aísla con E de R, se separa por electroforesis y se identifica por hibridación. Ahora se une a un vector que puede ser: Genomas de Retrovirus (Virus con respuesta lisogénica). El virus se modifica genéticamente eliminando los genes de virulencia y sustituyéndolos por el gen deseado o lo que es lo mismo, los genes que se quieren clonar. Cromosomas artificiales (YAC, Yeast artificial chromosomes) (yeast, levadura). Son trozos de ADN recombinante que se mantienen estables en el núcleo de levaduras. Plásmidos Ti, para células vegetales. Solo lo hace la bacteria Agrobacter tumefaciens, que lleva el plásmido. Se manipula quitándole la virulencia y sustituyendo estos genes por los que interesa clonar en la planta. Tema 23. Ingeniería genética Página 4

5 Las células hospedadoras son vegetales (plantas transgénicas), levaduras, o células animales (cultivos de tejidos como piel o hígado, animales transgénicos). Para introducir el vector + el ADN se emplean: Microinyección con capilares de 1,5 micras. Se aplica a óvulos fecundados, el gen se incorpora al genoma celular y es estable. Así se obtienen animales transgénicos. Electroporación, consistente en producir poros en la membrana celular por descargas eléctricas, para que pueda entrar el ADN recombinante. Pistola de genes, con microproyectiles revestidos de ADN. Liposomas: micelas bicapa que contienen ADN. La micela se funde con la membrana plasmática. Plásmidos Ti 3. INGENIERÍA GENÉTICA Es el cambio o alteración del genoma de un ser vivo por manipulación de su ADN. El cambio va desde introducir o eliminar genes en un genoma, modificación de un gen, cambiar las pautas de expresión de un gen, hasta la clonación de seres vivos, órganos o tejidos. Todo esto se hace para: Estudios evolutivos: por poca muestra que se tenga, se amplía gracias a la PCR y se obtienen copias de esa información, para poderlos comparar con genes de organismos actuales. Estudios antropológicos: enfermedades genéticas detectadas en individuos momificados. Huellas dactilares: Muestras de ADN (que se amplían con la PCR) procedentes de pelos, saliva, semen, piel.... para pruebas de paternidad (por hibridación) Aplicaciones biosanitarias. Uno de los objetivos de la ingeniería genética es la sobreexpresión de proteínas celulares. El fin es, una vez aislado el gen e introducido en un vector con un promotor muy activo, conseguir una cantidad de proteína fácilmente aislable para su estudio o utilización. Otro de los logros obtenidos con esta técnica ha sido el conocimiento de los sistemas de regulación de la expresión génica y los momentos de la vida celular en que se desarrollan, así como los factores de inhibición. Las aplicaciones biosanitarias de la ingeniería genética son numerosas, por ejemplo la síntesis de proteínas humanas. La insulina, la hormona del crecimiento o proteínas de la sangre, como la Tema 23. Ingeniería genética Página 5

6 eritropoyetina o los factores de coagulación, son algunos de los productos que se pueden conseguir con técnicas de ingeniería genética. Concretamente el gen de la insulina se ha introducido en Saccharomyces cerevisae. También se obtienen vacunas con ingeniería genética. Los factores antigénicos son fundamentalmente proteínas. Se clona el gen que las genera y así no se tiene que emplear todo un microorganismo, que conlleva riesgo, ya que puede que no se haya inactivado totalmente. Se estudia el producir plantas portadoras de vacunas. Desde hace unos años se están empleando vacunas recombinantes y vacunas polivalentes. En las primeras se eliminan los genes que determinan la virulencia del virus, y las segundas llevan factores antigénicos de varias enfermedades. Terapia génica. En el futuro puede que no se trate a los enfermos administrando sustancias que el enfermo no produce. Se trata de introducir en el paciente los genes que hacen que se forme la sustancia deseada. También se intenta sustituir los genes defectuosos. Diagnóstico. Se utilizan sondas genéticas que hibridan con fragmentos de un gen patógeno. Hoy se diagnostican así enfermedades causadas por Salmonella, Pseudomonas o Campylobacter Utilización de organismos transgénicos como modelos vivos de enfermedades humanas o para la producción de proteínas humanas, medicamentos, vacunas, interferones o anticuerpos. Actualmente se usan cabras transgénicas para la obtención del activador tisular del plasminógeno humano, que se usa para disolver coágulos. También soja y maíz transgénicos para la producción de anticuerpos monoclonales. Asimismo hay cerdos transgénicos que producen hemoglobina humana. Aplicaciones agrícolas y ganaderas. Para incrementar la producción de carne, leche y para mejorar la calidad nutricional de estos productos se introducen en otros animales de granja los genes de la hormona del crecimiento, o genes para producir individuos capaces de resistir enfermedades y ambientes adversos. Se crean así plantas capaces de resistir a plagas, fabricación de herbicidas, resistencia a condiciones ambientales adversas como frío, sequía, alta salinidad, etc. Hay maíz que contiene el gen de la toxina de Bacillus antracis, que actúa como insecticida para muchos insectos, pero es inocua para el hombre. También tomates que no se estropean rápidamente. Además se han conseguido organismos clónicos por dos métodos distintos: Tema 23. Ingeniería genética Página 6

7 1. Por disgregación de células embrionarias, separando las células de la mórula, de modo que cada una se comporta como un cigoto. 2. Pasando el núcleo de una célula embrionaria a un ovocito sin núcleo, que también funciona como un cigoto. (Oveja Dolly). Tema 23. Ingeniería genética Página 7

8 4. PROYECTO GENOMA HUMANO Consiste en la secuenciación completa de los cromosomas del genoma humano. Pretende conocer la secuencia de todo el ADN de las células humanas, localizar las posiciones de cada gen en el cromosoma en el que se encuentra, conocer las relaciones entre los genes y descubrir e identificar nuevos genes. Se completó la secuencia en La secuencia completa contiene 3500 millones de pares de bases en las células haploides. Por lo visto, sólo una pequeña fracción del ADN codifica la formación de proteínas o ARN (2 %). Del resto se ignora, por ahora, su función. Aproximadamente el 76 % del total, denominado ADN basura, no se ha relacionado aún con ningún gen; de él alrededor del 50 % es ADN altamente repetitivo. Se piensa que sólo el 0.1 % del ADN es responsable de las diferencias entre humanos. El descubrimiento del genoma humano fue el punto de partida para el desarrollo de numerosas investigaciones en tratamientos de enfermedades. Una de las últimas tendencias que podemos encontrar en biotecnología aplicada a la medicina es la preparación de terapias personalizadas en función de las características del genoma de una persona. Las primeras experiencias en relación a terapias personalizadas a partir del descubrimiento del genoma humano están concentradas sobre enfermedades como la leucemia linfática. En España, la Escuela de Biología Molecular Eladio Viñuela es uno de los principales centros a nivel mundial en el desarrollo de terapias personalizadas. En las primeras investigaciones instrumentalizadas por el equipo español se encontraron diferentes métodos que dan indicios sobre los métodos de replicación de algunos de los virus más nocivos que pueden afectar a una persona. Como anticiparon los especialistas de este instituto de investigación, los nuevos avances en relación al genoma humano y las posibilidades de tratar diferentes afecciones son un poco lentos, pero prometen resultados excepcionales. Solo con el desarrollo de las terapias personalizadas a partir de los datos del genoma humano se podrá avanzar en la preparación de tratamientos según la constitución física de una persona, considerando las distintas maneras en las que su cuerpo responderá a los tratamientos a su disposición. A diferencia de otras orientaciones seguidas por equipos de investigación en algunos países del mundo, la dirección que siguen los especialistas de la Escuela de Biología Molecular Eladio Viñuela se concentra únicamente en el tratamiento de enfermedades. Por ello, aún no se han hecho estudios para anticipar el riesgo de una persona de sufrir alguna enfermedad. El genoma humano, sin embargo, contiene un cifrado que podría ofrecer información vital a la hora de la prevención y el tratamiento de enfermedades. Tema 23. Ingeniería genética Página 8

9 BIBLIOGRAFÍA o SANZ ESTEBAN, M. & colab. Biología 2º bachillerato. Proyecto Tesela. Oxford Educación o ALCAMÍ, J. & colab. Biología 2. Editorial SM o ROMERO, A. Proyecto Biosfera Genética. en adelante o SÁNCHEZ GUILLÉN, J. L. Proyecto Educastur. RIA/INDICE.htm o o IES EL PINAR. Para la REFLEXIÓN: Repercusiones sociales y éticas de la manipulación genética. Tema 23. Ingeniería genética Página 9