Biotina: se usa uno de los dntps biotinilado. Detección: Streptavidina conjugada con enzima (ALP) o anti-biotina. Usos: NB, SB, hibridación in situ

Transcripción

1 Northern blot

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5 Marcación no radioactiva: Digoxigenina: se usa uno de los dntps marcado con digoxigenina Detección: Anticuerpo conjugado con enzima (ALP) o fluorocromo Biotina: se usa uno de los dntps biotinilado. Detección: Streptavidina conjugada con enzima (ALP) o anti-biotina Usos: NB, SB, hibridación in situ

6 Marcación flourescente: Se usa uno de los dntps marcado con un fluorocromo: Cyanin 5, Cyanin 3, fluoresceína, otros. Detección de la sonda Usos: FISH, microarrays Cy5 Cy5-dCTP

7 Métodos de marcación de Sondas generadas por síntesis de DNA: -Random primers -Nick translation -Marcación por PCR Sondas generadas por marcación de extremo - Polinucleótido quinasa

8 Marcación con Random Primers Primers ramdom compuestos por todos las posibles combinaciones de hexanucleótidos. DNA Pol (Klenow frag) Klenow fragm de DNA pol I (E Coli). 5 3 pol y exonucleasa, no 3 5 exonucleasa. 32 P-α-dCTP 32 P-α-dCTP

9 Marcación por nick translation DNasa I (nicks al azar ) DNA pol (DNA 5' 3' usando el 3'-OH del nick como primer.) La actividad 5' 3 exonucleasa de la DNA pol I remueve nucleótidos y la actividad polymerasa sintetiza DNA incorporando uno de los dntps marcados 32 P-α-dCTP

10 Marcación de extremos 5 o 3 Los oligonucleótidos se marcan enzimáticamente en el extremo 3 por el agregado de dntpsmarcados o por fosforilacióndel extremo 5 TdT (Transferasaterminal)cataliza la incorporación de dntpsal 3 OH en ausencia de templado. PNK (polinucleotidokinasa) Fosforilael extremo 5 a partir de g-atp PNK (polinucleotidoquinasa)

11 Reacciónen cadena de la polimerasa Inventadaen1985porKaryB.Mullis PremioNobeldeQuímica,1993 PCR: Polymerase chain reaction Reacción en cadena de la polimerasa Es una técnica que permite hacer millonesde copias a partir de una muestra ínfima de DNA. Polimerasa Primers Templado dntps: datp, dctp, dgtpy dttp. Mezcla de los 4 deoxirribonucleótidos trifosfato que componen el DNA Mg ++ Termocicladora

12 94 C 50 C 72 C

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16 Visualización Geles de agarosa, BrEt

17 Características de los primers 1. Longitud del primer nt Muy largos: errores en la síntesis, fallas en el annealing: bajo rendimiento 2. Tm (Tº melting) Tº a la cual la mitad de las bases del primer están apareadas con el DNA molde. El 50% del largo del primer esta apareado con el templado Tm = 2(A+T) + 4(G+C) Tm aumenta con la longitud del primer y el contenido (G+C) Tm: 55º-70ºC -2 primers: Tm similares Tº annealing 5ºC por debajo de Tm (50 C) 3. Especificidad Reconocer una secuencia única dentro del DNA templado Especificidad de un primer depende de la longitud (más largo menos probabilidad de encontrar 2 seq iguales en el DNA templado).

18 Un primer de 15 nt puede funcionar bien para amplificar un fragmento de un plásmido, pero puede ser inespecífico para amplificarlo de DNA genómico 4. Complementariedad de secuencias Sin complementariedad intra-o inter-primers. 5. Contenido G/C; poli( T/A-G/C ) 45-55% GC (para tener buen Tm) 6. Extremo 3 G o C

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20 PCR se puede usar para clonado Primers con sitios de corte para ER

21 Tipos de PCR: RT-PC, Ror Reverse Transcriptase PCR Real Time PCR or qpcr Inverse PCR AFLP PCR Colony PCR In Situ PCR Nested PCR Single Cell PCR

22 EcoRI BamHI PstI Pvu II SmaI Hind III COLONY PCR MCS

23 RT: Transcripción reversa

24 TEMPLADO de PCR

25 RT-PCR semicuantitativa Comparación con genes Housekeeping genes presentes en todas las células se expresan constitutivamene : GAPDH Actina Tubulina

26 REAL TIME PCR

27 Detección y cuantificación del producto de PCR mediante una sonda fluorescente que se une al DNA o un agente intercalante. Esta señal fuorescente aumenta en proporción directa al aumento del producto de PCR y se registra a lo largo del tiempo

28 Sistemas de detección: agentes fluorescentes intercalantes SYBR Green sondas marcadas con fluorocromos Taq (actividad 5-3 exo) hidroliza la sonda se separa el fluorocromo del quencher

29 FIGURE 13. Real-time PCR quantitation of retinoblastoma mrna. RT-PCR of duplicate samples of total HeLa RNA was performed with the PLATINUM Quantitative RT-PCR THERMOSCRIPT One-Step System (cdna synthesis was performed at 60 C) and detected using a FAMlabeled Molecular Beacon probe (400 nm) on an ABI Prism Panel A. Relative fluorescence intensity of duplicate samples during PCR. Panel B. Standard curve. CT

30 SECUENCIACION

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36 Next-generation sequencing technologies

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40 POLIMERASA RNA POL II

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42 MAQUINARIA REGULATORIA -Factores Regulatorios de Transcripción Activadores o Represores -Co-activadores Co-activadores o co-represores

43 MAQUINARIA TRANSCRIPCIONAL Componentes Maquinaria basal: reconocimiento de promotor y transcripción Maquinaria regulatoria: control de velocidad gene específica de maquinaria basal

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46 MIDIENDO LA EXPRESIÓN GÉNICA La expresión génica es una medida de los eventos de transcripción y traducción Nivel de mrna = nivel de Proteina? Griffen TJ et al. (2002) Mol. Cell. Proteomics 1: Comparación de niveles de proteina (MS, ICAT) y los niveles de niveles de mrna (microarray) para 245 genes en levaduras (medio con galactose/ethanol) En un número significativo de genes se detectaron diferencias entre los niveles de mrna y los niveles de proteína Regulación traduccional

47 Como una primera aproximación se mide abundancia de transcripto RT-PCR (real-time PCR) Northern/Southern Blotting DNA Microarrays or Gene Chips Metodos basados en secuenciación

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50 DNA microarrays

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52 ARRAYS ALTA DENSIDAD

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54 37 C RPB1 28 C SRB4 semejante (Med17) 5735 genes analizados (levaduras)

55 ChIP Inmunoprecipitación de Cromatina

56 CHIP on CHIP INPUT:DNA purified from sonicated cell extract prior to treatment with antibody, with crosslinks reversed

57 Correlación de Pol con CTD Ser2 = POCA SEÑAL= Polimerasa NO trasncripcionalmente activa en genes con Pol II pausada