NTC = NO TEMPLATE CONTROL

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Alba Montes Correa
hace 6 años
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2 NTC = NO TEMPLATE CONTROL

3 Químicos usados en la qpcr para detectar los productos: específicos o inespecíficos Inespecíficos: agentes intercalantes que se unen al DNA doble hebra y detectan cualquier producto. Más usado: el colorante SYBR Green I. Por cada molécula de producto se unen varias moléculas de colorante, productos más largos producen más fluorescencia Los productos se distinguen al ver la curva de melting o disociación (productos inespecíficos, dímeros de primers) 23

4 Curvas de disociación o Melting curves (Lo hace el equipo al finalizar la PCR): aplica un gradiente de temperature creciente para monitorizar la cinética de disociación de los fragmentos amplificados Si graficamos el cambio en la emisión de fluorescencia en función del aumento de temperatura cuando el ADN doble hebra con el Syber green unido se disocia a ADN de cadena simple, vemos una caída brusca que es la Tm (se libera el colorante) Graficando df/dt vs Temperatura vemos la temperature exacta de melting. La Tm es afectada por la longitud, contenido de GC, presencia de mismatch, diferentes productos tienen distinta Tm. Equivale a ver el gel. El pico debe ser angosto, simétrico, sin hombros. A, B y C muestra la Tm de los productos amplificados en tres tubos/pocillos distintos 24

5 Curva de disociación o Melting curve Puedo distinguir los productos obtenidos de acuerdo a la Tm. También los dímeros de primers (que se forman con el anillado inespecífico y elongación de los mismos). Los dímeros de primers disminuyen la eficiencia de la reacción. No aplica cuando usamos TaqMan porque el fluoroforo se libera irreversiblemente y queda en solución) 25

6 Los productos de la qpcr, se pueden distinguir en la curva de melting si el contenido de G+C es distinto

7 Específicos : Sondas lineales (TaqMan probes) Sondas estructuradas (Molecular Beacons, Scorpions, Light Cicler) -Sondas lineales o de hidrólisis: (TaqMan) consiste en una sonda fluorogénica (o sea marcada con un fluoróforo) que se une (anilla) al producto de PCR específicamente en una zona que está muy cerca del sitio de unión de uno de los primers. Esta sonda tiene en el 5 un cromóforo reportero fluorescente (R) y en el extremo 3 un quencher (Q). - Con las sondas Taqman se requiere que la polimerasa que se usa tenga actividad 5 nucleasa y se basan en un fenómeno llamado FRET (Transferencia de energía de resonancia de Förster) cuando dos fluoróforos en estrecha proximidad interaccionan. Cuando la sonda está intacta el Q apaga la fluorescencia de R mediante FRET. Si la secuencia target aparece (está en el producto de PCR) la sonda se une y como está downstream del sitio de uno de los primers es degradada por la acividad 5 nucleasa de la Taq polimerasa, liberando el R del Q, el cual empieza a emitir fluorescencia y aumenta cada vez más a medida que aparece el producto. VENTAJAS de Taqman: - específica (sondas de 30 nt o menos con Tm alta) - permite hacer qpcr multiplex (se pueden marcar distintas sondas con distintos fluoróforos) DESVENTAJA: hay que diseñar una sonda para cada producto, más costoso. 27

Importante: la Tm de la sonda Taqman tiene que ser

entre producto y fluorescencia (o sea no debe formarse

8 Importante: la Tm de la sonda Taqman tiene que ser unos 10 ºC mayor que la de los primers. Esto asegura que la sonda esté unida antes de que los primers empiecen a elongarse y que hay una correlación entre producto y fluorescencia (o sea no debe formarse producto sin sonda unida!!). La sonda anilla 3-12 nt después del primer. 28

TaqMan assays are conventionally performed as a two- step PCR reaction consisting of a product melt at 95 C, followed by primer annealing and Taq DNA polymerase extension at 60 C (Figure 10).

9 TaqMan assays are conventionally performed as a two- step PCR reaction consisting of a product melt at 95 C, followed by primer annealing and Taq DNA polymerase extension at 60 C (Figure 10). For these assays, the probe is designed with a Tm 8 10 C higher than the Tm of the primers. Using the higher Tm for the probe ensures hybridization to the target before extension can occur from the primer, so there will always be a corresponding increase in fluorescence signal for every amplified copy that is produced. 29

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Kit diseñado para la detección y diferenciación de los

diferenciarlos), Zika (ZIKA) y el Chikungunya (CHIKV) de

Control exógeno: se agrega para ver que no haya inhibición

para normalizar fluctuaciones de fluorescencia debidas al

11 Kit diseñado para la detección y diferenciación de los virus Dengue (detecta los cuatro subtipos sin diferenciarlos), Zika (ZIKA) y el Chikungunya (CHIKV) de manera simultánea. Control exógeno: se agrega para ver que no haya inhibición de la PCR que provenga de la muestra Referencia pasiva: es para normalizar fluctuaciones de fluorescencia debidas al aparato no tiene que ver con la amplificación de un producto 5 FLUORÓFOROS que emiten a distinta longitud de onda 31

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