PCR: Reacción en cadena de la polimerasa Gonzalo Greif. Unidad de Biología Molecular. Institut Pasteur Montevideo

Transcripción

1 Índice: PCR: Reacción en cadena de la polimerasa Gonzalo Greif. Unidad de Biología Molecular. Institut Pasteur Montevideo Historia La Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Algunos tips experimentales Variantes de la PCR Una variante especial: PCR en tiempo real 1. Historia La reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés: Polymerase chain reaction) fue concebida por el Dr. Kary Mullis (ver recuadro) a principios de la década del 80. Si bien se discute que en el desarrollo final de la técnica participaron varios investigadores y que el proceso para la puesta a punto de la técnica involucró varios años, hay un consenso que la idea original fue desarrollada por el Dr. Mullis, y por ello obtuvo el premio Nobel unos años más tarde. En el libro Making PCR: a story of biotechnology, Paul Rabinow cuenta en detalle los acontecimientos históricos que dieron lugar a la invención de la técnica. Según cuenta en su página web ( la primera idea surgió en la medianoche de un viernes en abril de 1983, conduciendo con su Honda gris entre Cloverdale y Boneville e imaginando la reacción. La historia completa se encuentra contada de forma muy poética en su página web. Hasta ese momento obtener cantidad suficiente de ADN puro para realizar experimentos constituía la etapa limitante. La aparición de las enzimas de restricción en la década del 70 y el desarrollo de la tecnología del ADN recombinante a fines de los 70 habían hecho posible la obtención de fragmentos precisos de ácidos nucleicos para ser estudiados en detalle. Sin embargo, la invención de la reacción en cadena de la polimerasa produjo un salto tecnológico, permitiendo a los investigadores producir cantidades ilimitadas de ADN específico, sin depender del clonado de fragmentos de ADN en organismos vivos. Por otra parte la PCR mostró tanta versatilidad, que año a año se fueron desarrollando nuevas aplicaciones y variantes. Hoy es una herramienta Kary Mullis (1944 ). Kary Banks Mullis nació en 1944 en Lenoir, Carolina del Norte. Estudió en el Instituto de Tecnología de Georgia y en 1972 obtuvo un doctorado en bioquímica de la Universidad de California, Berkeley. Luego de un posdoctorado en la Universidad de San Francisco, se incorporó a la Corporación Cetus como químico. En los 7 años que estuvo allí ( ) trabajó en la síntesis de oligonucléotidos y desarrolló el concepto de la PCR. En 1986 fue designado director de biología molecular en Xytronyx Inc. en San Diego, donde continuó su trabajo en tecnologías de ADN y fotoquímica. En 1993 recibió el premio Nobel por su invención de la reacción en cadena de la polimerasa. El proceso que Mullis conceptualizó en 1983, es uno de los principales avances de la biología molecular del siglo XX. Actualmente es un Investigador en el Hospital de Niños e Insituto de Investigación en Oakland. Vive con su esposa, en Corona del Mar y en Anderson Valley, California. Fuente:

2 fundamental en cualquier laboratorio de biología molecular. 2. El método de la Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La PCR es una técnica enzimática in vitro utilizada paraa amplificar exponencialmente una región determinada de ADN situada entre dos regiones de ADN, cuya secuencia se conoce, a partir de una mezcla compleja de ácidos nucleicos. Para ello requiere: (i) el molde a partir del cual se generarán las copias, (ii) dos oligonucleótidos (cebadores o primers) específicos complementarios a una porción de la región que se desea amplificar, (iii) una enzima capaz de sintetizar ADN utilizando como molde ADN (una ADN polimerasa) o ARN (una ADN polimerasa ARNN dependiente) en el caso de la RT PCR (retrotranscripción seguida de PCR) y (iv) los deoxinucleóti idos (dntps) que serán incorporados a las cadenas nacientes de ADN (Figura 1). El resultado de la reacción son varios millones de copias del fragmento de ADN comprendido entre los dos oligonucléotidos específicos. Figura 1. Descripción del proceso de PCR en los primeros 3 ciclos dee reacción (tomado de Lauraa Espinosa Asuar, 2004: Guía práctica sobre la técnica de PCR).

3 Generalmente, la reacción de amplificación de PCR se describe en tres pasos característicos. La primera fase, denominada fase lag, en los primeros 5 10 ciclos (dependiendo de la cantidad de molde inicial presente en la reacción), dónde no se producen todavía loss fragmentoss específicos. La segunda, es la fase exponencial, en la cual en cada ciclo se duplican los fragmentos producidos en el ciclo anterior (figura 1) y por último, la fase plateau, en la cual no se produce más amplificación (Figuras 1,2). Figura 2. Cinética de la PCR. En la gráfica se muestran las diferentess fases del PCR graficando la cantidad de ADN generada en función de los ciclos de amplificación. En la tabla 1 se muestra la amplificación exponencial y la duplicación del fragmento específico en cada ciclo. Partiendo de una molécula del fragmento, al cabo de 30 ciclos se obtienen en teoría 1 billón de moléculas de ADN del fragmento amplificado (aunque la tabla no contempla realmente lo que sucede en la reacción, permite visualizar el poder de la amplificación exponencial). Tabla 1. Amplificación exponencial. La tabla indica la cantidad de fragmentos producidos teóricamente en cada ciclo, si se partiera de una copia única de ADN molde. Ciclo Copias de ADN En general cada ciclo de la reacción se divide en 3 partes (figura 3): a. Desnaturalización: en esta etapa, el ADN molde doble cadena se desnaturaliza y sus hebras se separan. Esto se logra aumentando la temperatura de la reacción, en general a 94 o C para asegurar que todas las moléculas se encuentrann en simple hebra y permitir que ocurra el segundo paso. b. Anillado o annealing: en esta etapa, la temperatura de la reacción disminuye para permitir que los oligonucleótidos cebadores que delimitan el fragmento que se desea amplificar se

4 unan a su región blanco. La temperatura de unión de los cebadores dependerá de la composición de bases de los mismos (ver apartado: Cebadores). c. Extensión: en este paso, la temperatura de la reacción es aquella que permite la actividad óptima de la enzima polimerasa presente en la reacción (ver apartado: ADN Polimerasas). Cebadores: Los cebadores o iniciadores de la reacción son oligonucleótidos cortos (entre 18 y 30 nucleótidos), complementarios a la secuencia blanco que se desea amplificar. Se utilizan dos cebadores en cada reacción, cada uno complementario a uno de las hebras del ADN molde, delimitando la región que se desea amplificar. A modo de ejemplo: 5.AATCGTAGC TACCGTCGAC..3 ATGGCAGCTG 5 Reverso Directo 5 AATCGTAGC 3.TTAGCATCG.ATGGCAGCTG..3 De la secuencia de estos cebadores dependerá la especificidad de la reacción. Veinte nucleótidos permiten una alta especificidad? Una molécula de ADN puede contener 4 tipos de nucleótidos: A, T, C o G. La probabilidad de encontrar cada uno de ellos es 1/4=0,25, entonces la probabilidad de encontrar una determinada de n bases es (0,25) n. Un cebador de 20 bases, tiene en teoría una probabilidad de (0,25) 20 =9,9e 13 de ser encontrada por azar. La respuesta a la pregunta planteada más arriba, entonces, es sí. Temperatura de anillado. En el segundo ciclo de la reacción de PCR, la temperatura utilizada es tal que permite la unión de los cebadores a su secuencia blanco. Esta temperatura se determina dependiendo de la temperatura de desnaturalización o melting de los mismos. La temperatura de desnaturalización (Tm) se define como la temperatura a la cual el 50% de las moléculas se encuentran desnaturalizadas. Hay varios algoritmos que permiten calcular dicha temperatura. En la práctica, una fórmula muy utilizada es la siguiente: Tm=4(G+C)+2(A+T), (ej: para la secuencia AGGTCGTGCA, la Tm=4(4+2)+2(2+2)=32 C, y en general se utiliza esta temperatura menos 5 grados, como primera aproximación a la temperatura de anillado. ADN Polimerasas: Las ADN polimerasas son enzimas que intervienen en la replicación del ADN. Son capaces de adicionar dntps a partir de la región 3 de un cebador y copiar una secuencia molde. Las polimerasas sintetizan el ADN en la dirección 5' a 3'. Ninguna ADN polimerasa conocida es capaz de comenzar una nueva cadena. Ella sólo puede añadir un nucleótido en un grupo 3' OH que ya existe. Por esta razón la enzima precisa un cebador que presente un grupo 3' OH al cual puede añadir el primer nucleótido. Las ADN polimerasas requieren Magnesio como cofactor para ser funcionales. En el desarrollo de la técnica, la enzima utilizada era una polimerasa aislada de E.coli (fragmento Klenow de la ADN polimerasa I), que presenta su actividad óptima a 37 o C, y se inactiva a 94 o C, es por ello que en cada ciclo era necesario agregar más enzima. Luego, se sustituyó por una polimerasa termoestable aislada de Thermus aquaticus (Taq), una bacteria termófila que vive en la proximidad de las fuentes de agua termal (entre 50 y 80 o C), es por esto que su enzima polimerasa es más estable, y permite soportar las temperaturas elevadas durante los ciclos de la PCR. En la actualidad se han descrito y utilizado diferentes polimerasas en la reacción de PCR. La elección de la enzima dependerá de factores tales como: la fidelidad de la enzima o tasa de error (capacidad de producir errores o no durante el copiado), la velocidad (cantidad de nucleótidos incorporados por segundo en la cadena naciente de ADN), la procesividad (capacidad de unirse al molde), la actividad exonucleasa (capacidad de corrección de errores), extremos del ADN resultante, etc.

5 Figura 3. Pasos durante el ciclo de reacción de la PCR. 3. Algunos Tips experimental es: Conceptualmente, la técnica de la reacción en cadena de polimerasa es sumamente sencilla, sin embargo la puesta a punto de una reacción en particular debe considerar algunos aspectos, para ser exitosa. En la presentee sección, repasaremos someramente algunos de estos elementos. a. Componentes Una reacción convencional de PCR se puede realizar con la siguiente fórmula: Componente dntps Tampón de reacción Oligo directo Oligo reverso Polimerasa Molde Agua libre de ADNasaa Concentración inicial en solución stock 2,5 mm 10 X 10 um (10 pmol/ul) 10 um (10 pmol/ul) 5 U/uL Depende Concentración final en la reacción 0,25 mm 1 X 1 a 5 um 1 a 5 um 1 U Depende Volumen paraa 20 ul (ul) 2 2 0,1 0,5 0,1 0,5 0,2 Dependee csp. 20 ul La cantidad de molde requerida depende del tipo de ADN que se trate (ADN genómico, plasmídico, etc). En general los tampones de reacción que se incluyen con las enzimas comercialmente disponible incluye una concentración estándar de Cloruro de Magnesio, que permite una actividad completa de la enzima.

6 La concentración de MgCl 2 presente en la reacción es una de las variables con las cuales se pueden poner a punto algunas reacciones. En la realización de la reacción, un punto importante es la homogenización de los reactivos. Las enzimas se encuentran en glicerol lo cual las hace más densas y tienden a estar en el fondo del tubo de reacción. b. Ciclos y Temperaturas: En cuanto a la elección de los ciclos y las temperaturas, los mismos dependerán de la cantidad inicial de la secuencia diana que se desea amplificar y las características de composición de bases, tanto del ADN blanco como de los cebadores. Típicamente, una reacción convencional utiliza 35 ciclos, siendo cada etapa de desnaturalización, anillado y extensión de 30 segundos. El tiempo de extensión también varía de acuerdo al tamaño del fragmento que se desea amplificar y la velocidad de la enzima con la cual estamos realizando la reacción. Cuando los fragmentos que se desea amplificar son mayores a 5000 bases, la extensión puede necesitar de 5 a 10 minutos. Las temperaturas de desnaturalización utilizadas son en general 94 o 95 o C, y la de extensión depende de la enzima utilizada, comúnmente si se utiliza la Taq se recomienda una temperatura de extensión de 72 o C. La temperatura de anillado es clave para tener éxito en la reacción, esta temperatura depende básicamente de la complejidad del ADN blanco y la composición de bases de los cebadores (ver apartado: Cebadores). c. Diseño de cebadores: Un punto clave de la optimización, quizás el de mayor importancia para realizar una reacción exitosa, es el diseño de los cebadores. Algunos puntos a considerar se detallan a continuación. La secuencia de los cebadores deberá tener una composición de bases tal que su contenido GC se encuentre entre 40 y 60 % (esto dependerá de la complejidad del ADN blanco a partir del cual realizaremos la amplificación, por lo que no siempre lo podemos respetar). Ambos cebadores deben tener una composición de bases, o al menos un contenido GC, y un largo similar. Estos factores están implicados en la temperatura de melting, que no debería variar más de 5 o C entre un cebador y el otro. El extremo 3 del cebador es muy importante y se busca que sea una base G o C (lo cual provoca mayor especificidad, debido a que son bases que se unen mediante 3 puentes de hidrógeno, en contraste con A y T que se unen mediante 2 puentes de hidrógeno). En los extremos 5 de los cebadores, no es necesario que haya un 100 % de complementariedad con la secuencia blanco, de hecho pueden adicionarse colas de 10 o más bases que luego permiten la clonación de estos fragmentos o la secuenciación con cebadores universales. Otro punto importante a considerar es la capacidad de esos cebadores de hibridarse consigo mismos o entre sí. Si un cebador posee una secuencia palindrómica interna, puede formar una horquilla (plegarse sobre sí mismo por complementariedad) y de este modo no estar disponible en la reacción. Además, si los extremos 3 de ambos cebadores son complementarios entre sí, pueden dar lugar a dímeros de cebadores, evitando así la amplificación del fragmento deseado y amplificando únicamente los dímeros. Generalmente, estos dímeros se forman inespecíficamente y se observan como fragmentos del tamaño de la suma del largo de ambos cebadores. Finalmente, para evitar la amplificación de secuencias inespecíficas, es importante chequear en bases de datos de secuencias de ADN (ej. GeneBank: ww.ncbi.nlm.nih.gov) la posibilidad de amplificación de otros blancos.

7 d. Otras consideraciones: Otros puntos a tener en cuenta son la calidad y cantidad del molde a partir del cual queremos realizar la amplificación. Se recomiendan relaciones espectrofotométricas 260/280 y 260/230 mayores a 1,8 2,0. Estas medidas aseguran una buena calidad de ADN con baja contaminación de proteínas y otros inhibidores. La utilización de kits de purificación comerciales facilita la obtención de un ADN o ARN (en el caso de una RT PCR) de buena calidad eliminando muchos de los posibles inhibidores de la reacción. e. Contaminación: Un punto clave en las reacciones de PCR es la minimización de la posibilidad de contaminación. Debido a la sensibilidad de la técnica (dada por la amplificación exponencial de fragmentos), es necesario tomar la mayor cantidad posible de recaudos para evitarla. En primer lugar, lo ideal es trabajar en tres áreas diferentes, separadas en lo posible físicamente, y a las cuales se debe acceder siguiendo un camino en el cual una vez llegada a la última área no es posible volver atrás (flujo uni direccional). La primera de las áreas, con su juego de pipetas exclusivo y zona UV para descontaminación, es para la realización de las mezclas de reacción (en esta área sólo debemos hacer la mezcla que incluye el tampón de reacción, la enzima, los dntps, el agua y los cebadores), esta área en general es conocida como área de pre PCR. Una vez finalizada esta etapa, donde se preparan la cantidad de reacciones necesarias para el trabajo, se pasa a la siguiente área, dónde únicamente se agregara tubo a tubo el ADN molde (área PCR). Siempre, debemos incluir un tubo blanco de reacción que debe tener todos los componentes de la mezcla excepto el molde, que sustituiremos con agua. Idealmente se pueden realizar 2 blancos, uno que cerraremos en el área de pre PCR, que permite detectar si hay contaminación de los reactivos, y otro que dejaremos abierto durante toda la manipulación para asegurar que no hubo contaminación durante la misma. También, en el caso de contar con un control positivo, la incorporación del mismo en cada tanda de reacciones es recomendable. Por último se pasa al termociclador (ver apartado: Termocicladores) y a la visualización de los fragmentos amplificados (ver apartado: Visualización de productos de PCR). Esta última área es conocida como área de post PCR. De acuerdo al flujo uni direccional, estos tubos nunca deben pasar al área de pre PCR. Se recomienda trabajar con túnicas diferentes en cada área. Idealmente, también se puede hacer uso de presiones diferenciales en las diferentes salas para minimizar los problemas de contaminación. Como veremos más adelante, la aparición de la PCR en tiempo real, minimizó uno de los mayores problemas de contaminación al evitar la apertura de los tubos una vez finalizada la reacción (principal fuente de contaminación de reacciones). Termocicladores: En los comienzos de la técnica no existían equipos de PCR automatizados, por lo cual se utilizaban diferentes baños termostatizados (a las temperaturas de desnaturalización, anillado y extensión) y manualmente se cambiaban los tubos de un baño a otro. El primer equipo desarrollado, de hecho, únicamente automatizó el cambio manual de tubos. Los equipos actuales constan, básicamente, de un bloque de metal que puede ser calentado o enfriado rápidamente (generalmente mediante el sistema peltier), con posibilidad de programar las temperaturas, rampas de subida y bajada de las mismas y los tiempos de cada etapa de los ciclos, así como la cantidad de ciclos. En general presentan una tapa térmica que evita la evaporación de la mezcla de reacción durante la etapa de desnaturalización.

8 Por último, el trabajo siguiendo procedimientos y normas GLP (Good Laboratory Practices) es recomendable para evitar contaminaciones. Visualización de productos de PCR: El procedimiento más común para el análisis de los fragmentos obtenidos en la PCR es la electroforesis, ya sea en geles de agarosa o de acrilamida. La electroforesis permite separar fragmentos de acuerdo a su tamaño. Los fragmentos de ADN (cargados negativamente) se desplazan por el gel a través de un campo eléctrico hacia el polo positivo. Los fragmentos más pequeños migran más rápido y son los que vemos más abajo en el gel. La elección de la matriz (agarosa o acrilamida) y el porcentaje en la cual separar los productos, dependerá del tamaño de los mismos y los largos diferentes que deseemos separar. Generalmente, los geles de agarosa se visualizan agregando Bromuro de etidio, un agente que se intercala en el ADN y fluoresce cuando es expuesto a la luz UV, y en el caso de los geles de acrilamida, la tinción se realiza con nitrato de plata, que por interacciones electrostáticas se une al ADN. PM Ejemplo Gel Agarosa: Gel de agarosa 1 % teñido con bromuro de Etidio dónde se visualizan productos de amplificación de diferentes tamaños (carriles 1, 2, 3 y 7) entre 250 y 500 bases. En los carriles 3 a 6, el tamaño parece ser el mismo. Sin embargo, la resolución de este tipo de gel no hace posible esta afirmación. 500 pb 250 pb 100 pb 4. Variantes de la PCR Una vez que el uso de la PCR se masificó, a partir de la década de 1990, han surgido variantes y nuevas aplicaciones a la técnica. El detalle de cada variante escapa a la finalidad del capítulo, por lo cual solo se hará mención a alguna de ellas y explicara de forma resumida. a. RT PCR: Es una variante de la PCR muy utilizada en la que se utiliza ARN como molde inicial en vez de ADN, y emplea una transcriptasa reversa (una polimerasa de ADN ARN dependiente) para realizar la síntesis de un ADN complementario al ARN (ADNc). En esta primera ronda, como cebador se pueden utilizar hexámeros (oligonucleótidos de 6 nucleótidos de secuencia aleatoria) que se unen al azar en cualquier región del ARN molde, o un oligonucleótido (en general un oligo dt) que permite la captura y la realización del ADNc a partir del ARNm o ARN con colas polia. Una vez que se obtiene el ADNc, se realiza la reacción de PCR convencional como se detalló más arriba.

9 b. PCR anidada o nested: Se trata de una técnica que aumenta la sensibilidad de la PCR. En este caso se trabaja con 4 cebadores, en una primera ronda se amplifica de manera convencional con los dos cebadores más externos a la región que se desea amplificar. El producto de este primer PCR se utiliza como molde para una segunda ronda que utiliza cebadores internos a la región previamente amplificada. La desventaja de esta técnica es la posibilidad aumentada de contaminación, y además no permite cuantificar la cantidad inicial de ADN molde presenta en la muestra analizada. c. PCR in situ: La PCR in situ consiste en una reacción de PCR en secciones histológicas o células, donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificación. Es realizada sobre preparaciones fijas en un portaobjetos. En la técnica de PCR in situ se realiza una primera amplificación de ADN blanco y luego detección mediante hibridación in situ convencional con sondas de ADN/ARN. d. PCR múltiplex: PCR en la cual se amplifica más de una secuencia en una misma reacción. Emplea dos o más pares de cebadores en un único tubo con el fin de amplificar simultáneamente diferentes fragmentos de ADN. Consiste en combinar en un único tubo de reacción todos los pares de cebadores de las secuencias que queremos amplificar, junto con el resto de los reactivos de la reacción en cantidades suficientes. Sus ventajas: se obtiene la información de varios loci en una sola reacción, requiere menor cantidad de molde para el análisis y menor cantidad de reactivos. Los ejemplos de PCR múltiplex son muy comunes en el diagnóstico de agentes infecciosos, donde se intenta amplificar varios tipos virales en el mismo tubo y al mismo tiempo (ej. Amplificación de Herpes Virus en muestras biológicas). Otras variantes de la PCR incluyen la PCR inversa, PCR de colonia, PCR asimétrica, PCR alelo específica, entre otras. 5. PCR en tiempo real: La PCR en tiempo real es hoy una de las variantes más utilizadas. Esta técnica permite, a diferencia del PCR convencional, la cuantificación de los productos de amplificación, además de otras oportunidades. La cuantificación es muy utilizada en lo que refiere al análisis de expresión génica. La PCR en tiempo real fue reportada por primera vez en un artículo de Higuchi y colaboradores (R. Higuchi y col., Biotechnology 1993, 11). Estos autores, utilizando una cámara para monitorear reacciones de PCR durante el curso del termociclado, detectaron la acumulación de ADN doble cadena en cada ciclo de PCR, evidenciado por un incremento en la fluorescencia producto de la adición de Bromuro de Etidio en la reacción. El aumento de fluorescencia se relaciona directamente con el número de copias de la molécula que está siendo amplificada, presentes inicialmente en la reacción. A menor número de copias presentes inicialmente, menor el número de ciclos necesarios para detectar fluorescencia. Mediante esta variación de la PCR es posible seguir la cinética de cada reacción en tiempo real, por lo que permite una cuantificación sensible y específica del blanco que se desea analizar, al utilizar la fase

10 exponencial de la curva de amplificación. Además, esta técnica presenta un amplio rango dinámico de cuantificación. En 1997 surgen los primeros equipos comerciales de PCRR en tiempo real, producidos por Applied Biosystems. Desde entonces han surgido numerosos equipos con diferentes propiedades, entree ellos destacamos el LigthCycler de Roche (hoy discontinuado), y el RotorGeneQ (producido en la actualidad por Qiagen). Junto al surgimiento de los equipos de PCR en tiempo real, surgieron también diferentes aproximaciones y estrategias para detectar la fluorescencia. En este sentido, el Bromuro de Etidio fue sustituido por el SYBR Green, una molécula que también se intercala en el ADN doble cadena, pero presenta mayor afinidad y especificidad que el Bromuro de Etidio. Si bien el SYBR Green continúa siendo utilizado en la actualidad, existe un amplio espectro de estrategias basadas en sondas específicas marcadas fluorescentemente que muestran mayor especificidad y permiten además de la cuantificación otras alternativas como el diagnóstico de polimorfismos puntuales, por ejemplo. A continuación nos centraremos en cuatro elementos importantes: Cinética de reacciones y concepto de ciclo umbral Químicas utilizadas en PCR en tiempo real Cuantificación absoluta y relativa Curvas de desnaturalizaciónn y detección de polimorfismos a. Cinética de reacciones y concepto de ciclo umbral Cómo observamos en la figura 2 de este capítulo, la cinéticaa de reacción del PCR es lo que observamos en cada corrida de PCR en tiempo real que realizamos (figuraa 4). Figura 4. Curva de amplificación realizada con diluciones seriadas en base utilizando SYBRGreen en equipo RotorGene de un fragmento de interés, Lo que se observa en la figura 4, corresponde a diluciones seriadas en base 1:10 del molde inicial, y las curvas de amplificación de cada una de ellas ( , , y 100 copias molde por reacción).

11 La línea roja horizontal representa el valor umbral de intensidad, a partir del cual las muestras comienzan su fase exponencial de amplificación. El ciclo umbral de cada muestra, es el ciclo en el cuál pasan en el umbral (indicado con la círculo rojo para la muestra de mayor concentración). En el ejemplo, queda clara la relación inversamente proporcional entre el ciclo umbral y la concentración inicial de molde presente en las reacciones. A mayor concentración, antes amplificará la muestra y menor será su ciclo umbral. Arriba a la izquierda, en la misma figura, se observa la curva de cuantificación generada a partir de estos datos, graficando el ciclo umbral en las ordenadas y el logaritmo de la concentración en las abscisas. Por lo tanto, dado una muestra, de la cual se desea conocer su concentración inicial de molde, sólo deberemos interpolar el ciclo umbral de esa muestra en nuestra gráfica de cuantificación y obtener un valor de concentración (esto lo veremos con más detalle cuando hablemos de cuantificación absoluta). b. Químicas utilizadas en PCR en tiempo real: Cómo mencionamos antes existen diferentes aproximaciones que utilizan la fluorescencia para medir la cinética del PCR, una forma de clasificarlos es la siguiente: Agentes intercalantes: En este caso, se utilizan moléculas fluorescentes que aumentan su emisión cuando se unen al ADN doble cadena, es el caso del Bromuro de Etidio y SYBR Green. La desventaja de esta estrategia es la inespecificidad, ya que los agentes intercalantes se unen a cualquier producto que este siendo producido durante la reacción, ya sea el específico que queremos medir, como productos inespecíficos, dímeros de cebadores, etc. Otra desventaja de esta estrategia es que no puede utilizarse en reacciones multiplex. Como veremos más adelante en este capítulo, es posible realizar curvas de desnaturalización y evidenciar presencia de dímeros de cebadores, aunque no es posible eliminar esa señal que será un ruido en nuestras medidas, cuando deseemos cuantificar. La ventaja de utilizar agentes intercalantes radica en que puede utilizarse para cualquier reacción de PCR y que es económico. Sondas: La utilización de sondas mejora sensiblemente la especificidad del método. Hay diferentes estrategias que se basan en sondas (Taqman, FRET, Molecular beacon, etc.). Aquí desarrollaremos únicamente las sondas de hidrólisis (ej.: Taqman) y las de hibridación (ej.: FRET) ya que son las más utilizadas. Sondas Taqman: Las sondas Taqman se hibridan de manera específica a una secuencia del producto de amplificación. En uno de los extremos de la sonda (el 5 ) se encuentra unido un fluorocromo reportero el cual mientras la sonda permanece intacta la emisión es apagada o quencheada por una segunda molécula unida al extremo opuesto de la sonda (el 3 ). Esta molécula es un quencher, es decir absorbe la emisión del fluorocromo reportero pero no la emite. Entonces, cuando la sonda está intacta no hay emisión del fluorocromo (Figura 5).

12 Figura 5. Esquema de la estrategia de sondas Taqman. Se muestra la sonda intacta, antes de producirse la amplificación, con el fluorocromo unido al extremo 5 (F) y el quencher en el 3 (Q). Se muestra el sitio de unión de los cebadores forward ( F) y reverso (R). Cuando se produce la amplificación, comenzando desde uno de los cebadores (en este caso el directo o forward) la actividadd 5 3 exonucleasa de la enzima ADN polimerasa degrada la sonda, separando físicamente el fluorocromo y el quencher, permitiendo ahora sí la emisión de fluorescencia. Cuánto mayor cantidad de producto generado, mayor sonda degradada y mayor emisión de luz (Figura 6). Figura 6. Esquema de la estrategia de sondas Taqman. Se muestra la sonda degradada, luego de la amplificación de la enzima a partir del cebador forward (F), y el fluorocromo separado del quencher. En naranja se muestra la hebra de ADN recién sintetizada. Sondas FRET: Las sondas FRET también se hibridan de manera específica dentro del productoo de amplificación, pero en este caso se trata de dos sondas. En la primera de las sondass se adiciona un fluorocromo en el extremo 3 y en la segunda sonda, que debe hibridar cerca de la anterior, se agrega un segundo fluorocromo unido al extremo 5. Las características de los fluorocromos son tales, que la longitud de onda emisión del fluorocromo de la primera sonda, coincide con la longitud de onda de excitación del segundo fluorocromo. En este caso, se da un intercambio de energía, y cuándo las sondas se aproximan, se excita el primer fluorocromoo pero se observa la emisión del segundo (Figura 7).

13 Figura 7. Esquema de la estrategia de sondas FRET. Se muestra la interacción entre ambas sondas y ambos fluorocromos sobre una de las hebras del ADN. El fluorocromo verde se excita a la longitud de onda que irradia el equipo, pero al estar próximo la segunda sonda la energía emitida por él es transferida al fluorocromo rojo, el que emite en una longitud de onda mayor, que es la detectada por el equipo. En este caso, las sondas no se degradan, sino que se hibridan y deshibridan siguiendo los ciclos de temperatura de la reacción. A mayor cantidad de producto generado, más pares de sondas pueden interactuar aumentando la intensidad de señal. Una de las ventajas de utilizar esta estrategia radica en la posibilidad de realizar curvas de desnaturalizaciónn al finalizar la reacción. Esto permite, por ejemplo, la identificación de polimorfismos puntuales (SNPs). Si diseñamos la sonda de manera tal, que la mutación que queremos detectar se encuentra enn la región de unión de una de las sondas, la temperatura de desnaturalizac ción de la sonda será diferente paraa cada uno de los alelos que estemos amplificando y este hecho hace que podamos distinguir mediante curvas de desnaturalización la presencia en homocigosis, heterocigosis o ausencia de la mutación buscada (ver ejemplo más adelante). También permite cuantificar, al igual que las sondas Taqman, y presenta una especificidad aún mayor debido a que utilizamos dos sondas en lugar de una. Asimismo, hay un incremento de la sensibilidad producto del FRET. Algunos tips en el diseño de sondas: Al igual que en el diseño de los cebadores se juega gran parte del éxito de una reacción de PCR convencional, el buen diseño de las sondas es fundamental para obtener buenas reacciones de PCR tiempo real. Las sondas deben tener su extremo 3 fosforilado, ya que de otro modo podrían actuar comoo cebador. Además no se recomienda que la base a la cual uniremos el fluorocromo sea una Guanina, ya que esta base tiene propiedades de quencher. Las temperaturas de melting de las sondas deben ser tales que estén unidas al molde cuando la polimerasa está copiando el ADN (se recomienda que se encuentre 10 grados por encima de la temperatura de melting de los cebadores). En el caso de las sondas FRET, las temperaturas de anillado de ambas sondas deben ser similares, ya que ambas deben estar unidas al molde para que se obtenga una señal de fluorescencia. La distancia entre sondas (en el caso de FRET) debe ser entre 1 y 5 nucleótidos, para permitir el intercambio de energía de fluorescencia. Además, en reacciones dónde utilizaremos sondas FRET, la enzima no debee poseer actividad exonucleasa 5 3 para no degradar las sondas.

14 c. Cuantificación absoluta y relativa: La cuantificación absoluta, es aquella en la cual se utiliza una curva estándar construida a partir de concentraciones conocidas del blanco que se desea amplificar y cuantificar. Es la estrategia elegida en muchos kits comerciales de PCR en tiempo real para cuantificar cantidad de virus presentes en muestras biológicas (ej. Carga viral de HIV, HCV). Como comentamos más arriba, se aprovecha la relación entre el ciclo umbral y la concentración inicial de molde presente en las muestras o estándares. Las curvas de calibración son altamente reproducibles, específicas y sensibles. Sin embargo debemos asegurarnos la calidad de los estándares que utilizamos ya que de ellos depende el resultado final de la cuantificación. El rango dinámico de cuantificación puede llegar a 9 órdenes de magnitud (ej copias iniciales de ácido nucleico). En el caso de los kits de diagnóstico, muchas veces se utiliza un control interno que se agrega a la muestra antes de ser extraído el ácido nucleico (ARN o ADN), que sigue todo el proceso de extracción y amplificación. Idealmente este control interno debe amplificarse con los mismos cebadores que el blanco que se desea cuantificar. En estos casos se utilizan sondas, específicas para cada uno de los amplicones, marcadas con moléculas fluorescentes con diferentes propiedades que permita distinguirlos. Una estrategia de cuantificación implica la realización de dos curvas estándar, uno para cada blanco (el de interés y el control interno) y luego una cuantificación relativa al control interno que se agregó al comienzo del procesamiento de la muestra, lo cual asegura una cuantificación precisa considerando las pérdidas de material durante la extracción. La cuantificación relativa es la estrategia utilizada para estudiar los cambios en la expresión génica entre diferentes muestras. En este caso, se realiza una RT PCR en tiempo real, la que permite determinar los cambios de los niveles de expresión de un determinado gen en diferentes muestras y se expresa el resultado relativo a un mensajero que no cambia durante el proceso que estamos estudiando (ej. un gen housekeeping) o un control interno que agregamos a cada muestra (como en el caso que mencionamos en el párrafo anterior). Existen diferentes modelos matemáticos para hacer estudios de expresión génica diferencial mediante cuantificación relativa. Aquí mostraremos dos métodos, uno de ellos no tiene en cuenta la eficiencia de la reacción de PCR y el otro sí tiene en cuenta este factor. En el primer caso se asume una eficiencia de 100 % (es decir que el blanco de amplificación se duplica en cada ciclo): Ecuación 1. Ecuación 1. R = 2 (ΔCt gdi ΔCt gh)experimental (ΔCt gdi ΔCt gh)control ( ΔΔCt ) = 2 Dónde gdi=gen de interés y gh =gen housekeeping, de este modo, se obtiene una relación entre dos condiciones (experimental vs. control) para un gen de interés utilizando para normalizar un gen housekeeping. (Referencia: Livak and Schmittgen. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real Time Quantitative PCR and the ΔΔCt Method. Methods 25, 2001).

15 En el segundo caso, se realiza una corrección basándose en la eficiencia de cada reacción (para el gen de interés y para el gen normalizador): Ecuación 2. Ecuación 2. (ΔCt gdi Control ΔCt gdi Muestra) R = Eficiencia gdi (ΔCt gh Control ΔCt gh Muestra) ) Eficiencia gh En este método desarrollado por Pfaff y colaboradores (Nucleic Acids Res (9): E45), se considera la eficiencia de la amplificación de cada uno de los blancos que se analizan. Para ello se realiza una curva de calibración (sin necesidad de conocer realmente la cantidad de moléculas iniciales en la reacción, sino haciendo diluciones seriadas a partir de un stock) y a partir de la pendiente de esta curva se calcula la eficiencia de la reacción mediante la Ecuación 3: Ecuación 3. Eficiencia (E) = [10 ( 1/pendiente) ] 1 De esta manera se realiza una aproximación más realista, ya que la eficiencia de un experimento de PCR difícilmente alcance el 100% como plantea el primer método. d. Curvas de desnaturalización y detección de polimorfismos puntuales. Las curvas de desnaturalización pueden realizarse cuando se utilizan agentes intercalantes y en estrategias con sondas de hibridación (no en el caso de sondas de hidrólisis). Estas curvas se realizan al finalizar la reacción, es decir, cuando las reacciones alcanzan la fase plateau. Para ello se aumenta la temperatura gradualmente desde por ejemplo o C hasta 95 o C. De esta manera, los productos que se encuentran hibridados, y con una intensidad de fluorescencia alta (ya sea por el agente intercalante o por la sonda hibridada) comienzan a desnaturalizarse provocando que el agente intercalante del ADN doble cadena, o que las sondas se separen de su blanco, este hecho provoca una disminución de la señal de fluorescencia que puede seguirse en función de la temperatura. Cuando hay un punto de inflexión en esta curva (Figura 8), el mismo corresponde al punto de desnaturalización o temperatura de melting (Tm). Al calcular la derivada de la Intensidad de fluorescencia en función de la Temperatura, y graficarla nuevamente en función de la temperatura se observan gráficas como las de la Figura 9.

16 15 Fluorescence ºC Figura 8. Curva de desnaturalización. Se gráfica la fluorescencia en función de la temperatura. Las líneas verdes corresponden a las muestras de la Figura 4. La línea negra es la curva correspondiente a un blanco de amplificación. 2 1,5 df/dt 1 0, ºC Figura 9. Curva de desnaturalización derivatizada. Se gráfica la derivada de la fluorescencia en función de la temperatura en las ordenadas, y la temperatura en las abscisas. Lo que se observa es un pico correspondiente a la Tm para las muestras en verde. En negro, el blanco de reacción presenta un pico de menor Tm que se corresponde con la presencia de dímeros de cebadores. La posibilidad de realizar este tipo de curvas permite distinguir la presencia de dímeros de cebadores en la reacción o productos inespecíficos que presentan, en general, una temperatura de desnaturalización menor que la del blanco específico. En la Figura 9, puede verse un pico de desnaturalización en la muestra que corresponde al blanco de reacción, dónde al no haber muestra para amplificar se favorece la formación de dímeros. Por lo tanto, en este caso, se observa una señal de amplificación en las curvas de amplificación, que no implica una contaminación de la muestra ya que no hay un pico a la Tm esperada. Por último es posible detectar polimorfismos puntuales mediante la realización de estas curvas, ya sea utilizando sondas de hibridación, como con una nueva generación de agentes intercalantes (Sito9 Green Fluorescent nucleic acid stain o EvaGreen dye) y la posibilidad de los equipos de realizar curvas de desnaturalización más precisas (HRM: por high resolution melting) (Figura 10).

17 Figura 10. Curvas de desnaturalización obtenidas con HRM. Se observa los diferentes puntos de inflexiónn en el caso de una mutación puntual G por A y se muestran los tres posibles genotipos. A la derecha se observan las mismas curvas pero mostrando la diferencia respecto a una muestra normal, en este caso se acentúan las diferencias y es más fácil determinar los diferentes genotipos (imágenes obtenidas de verde quantification.de/ab hrm guide.pdf). Las curvas en rojo corresponden al homocigota normal, en corresponde al homocigota mutado y en azul el heterocigota paraa la mutación (es decir un alelo normal G y un alelo mutado A ) En el caso de las sondas de hibridación (como FRET), el polimorfismo provoca una inestabilidadd en la sonda en el caso de estar presente (al no tener una complementariedad perfecta) provocando una disminución en la temperatura de desnaturalización en los alelos que poseen la mutación. Figura 11. Curvas de desnaturalizaciónn obtenida con sondas FRET. Se observa loss diferentes puntos de inflexión en el caso de una mutación puntual G por A y se muestran los tres posibles genotipos (en este caso particular, la curva roja corresponde a un homocigota normal, la curva verde a un homocigota mutado y la curva azul, que muestra ambos picos, a un heterocigota para la mutación estudiada).

18 Comentarios finales: Para finalizar este capítulo mencionaremos algunas de las aplicaciones de la PCR y PCR en tiempo real. Las mismas abarcan desde la investigación básica hasta la aplicada, pasando por el diagnóstico humano a la detección de Organismos Genéticos Modificados en vegetales. Algunos ejemplos de aplicaciones del PCR son: Investigación: Clonación Búsqueda de nuevos genes Metagenómica Análisis filogenéticos Análisis de ancestría Análisis de expresión diferencial etc. Diagnóstico: Detección de mutaciones puntuales e Inserciones/Deleciones asociadas a enfermedades genéticas Análisis de parentesco Cuantificación viral Pronóstico de enfermedades mediante análisis de cuantificación de la expresión de determinados genes. etc.

19 Lecturas recomendadas: 1. Mullis y colaboradores. Specific Enzymatic Amplification of DNA In Vitro: The Polymerase Chain Reaction. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1986;51 Pt 1: ). 2. Saiki y colaboradores. Enzymatic amplification of β Globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science Dec 20;230(4732): Primer artículo publicado dónde se describe método de PCR. Y se observa una aplicación directa. Este grupo incluye a Mullis, y a otros investigadores que participaron en la puesta a punto de la técnica y la hicieron posible. Más allá que se considere a Mullis el autor conceptual de la técnica. 3. Nobel Lecture: Dr Kary B. Mullis, La Jolla, California, U.S.A., for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method. 13 octubre Wilhelm y Pingoud. Real Time Polymerase Chain Reaction. ChemBioChem 2003, 4, Espinosa Asuar Laura Guía práctica sobre la técnica depcr. En: L. E. Eguiarte, V. Souza y X. Aguirre (ed Ecología molecular. INE, CONABIO y UNAM.) 6. Livak y Schmittgen. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real Time Quantitative PCR and the 2 [Delta][Delta]CT Method. Methods,25(4): , Michael Pfaff. A new mathematical model for relative quantification real time PCR. Nucleic Acids Research, 29(9): , Stephen A. Bustin. A Z of Quantitative PCR. International University Line (ISBN ). Otros recursos interesantes: 1. www. Karymullis.com (página personal de Kary Mullis) 2. quantification.info/ (página web realizada y mantenida por Pfaff y colaboradores con mucho material sobre la PCR en tiempo real) dna.com (página web de la empresa IDT, proveedora de oligonucleótidos, se puede encontrar material educativo y software para el diseño de cebadores y sondas). 4.