TIPIFICACION HLA. Bioq. Eliana Palomino Lab. De Histocompatibilidad Hospital Privado

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Consuelo Espinoza Ayala
hace 8 años
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1 TIPIFICACION HLA Bioq. Eliana Palomino Lab. De Histocompatibilidad Hospital Privado

2 Tipificación HLA: Estudio mediante el cual se determina cuales de todas las variantes conocidas del locus HLA están presentes en un individuo determinado.

3 Muestra: Extracción de sangre entera, anticoagulada con EDTA.

4 Métodos de tipificación HLA Serología Linfotoxicidad medida por complemento: CDC Biología molecular PCR SSP (Primers de secuencia específica) PCR SSOP Reversa (Sondas de oligonucleotidos de secuencia especifica) LUMINEX SBT (Tipificación basada en la secuencia)

específica) PCR SSOP Reversa (Sondas de oligonucleotidos de

5 Tipificación Serológica: Principio: poner en contacto linfocitos aislados del sujeto a estudiar con un panel de aloanticuerpos o anticuerpos monoclonales anti- HLA capaces de reconocer determinadas especificidades antigénicas.

de aloanticuerpos o anticuerpos monoclonales anti- HLA

6 Tipificación serológica Se utiliza una suspensión de linfocitos viables obtenidos a partir de sangre periférica, utilizando Fycoll-Hypaque (densidad g/ml) Separación de los L T y B con perlas inmunomagnéticas Complemento de conejo Placas Terasaki con sueros caracterizados Placas con Terasaki anticuerpos monoclonales

077 g/ml) Separación de los L T y B con perlas inmunomagnéticas Complemento de

8 Separación de los Linfocitos T y B con perlas inmunomagnéticas PERLAS INCUBAR SEPARAR LAVAR

9 Citotoxicidad dependiente de Complemento CDC

10 Ventajas y desventajas Ventajas: Técnica fácil,no se requiere de equipamiento costoso Se realiza en 3 hs Utilizando sueros monoclonales se obtienen resultados aceptables de bajo nivel de resolución Desventajas Se requieren mayores volumenes de sangre Se requieren linfocitos viables Dificultoso encontrar antisueros para los especificidades raras

bajo nivel de resolución Desventajas Se requieren mayores volumenes de sangre Se

11 Métodos de tipificación HLA Serología LInfotoxicidad medida por complemento: CDC Biología molecular PCR SSP (Primers de secuencia específica) PCR SSOP Reversa (Sondas de oligonucleotidos de secuencia especifica) LUMINEX SBT (Tipificación basada en la secuencia)

12 Secuencias target HVR HLA clase I HVR HLA clase II HVR* α 2 α 1 β 1 α 1 DQ -DP α 3 β 2 m β 2 α 2 Para HLA de clase I, los exones 2 y 3 de los genes de la cadena pesada (α1, α2) Para HLA de clase II, el exón 2 de la cadenas alfa y beta Samaniego M, et al. Clin Transplant.2006;503

los genes de la cadena pesada (α1, α2) Para HLA de clase II, el exón

13 SSP-PCR Paneles de pares de primers de secuencias específicas, cuyas secuencias discriminan las diferentes variantes que puede presentar el locus. Cada reacción de PCR se realiza en un tubo separado Cada tubo contiene un par de primers específicos y un par de primers como control interno.

14 Amplificación por PCR Electroforésis en gel de agarosa 2% Visualización de los productos de amplif y confirmación del tamaño (bp) de las reacciones + La tipif HLA es deducida de acuerdo al pattern de reacciones + y -

confirmación del tamaño (bp) de las reacciones + La

15 HLA-DR SSP-PCR HLA-A*11 HLA-A*24 HLA-B*39 HLA-B*44 HLA-DR*13 HLA-DR:15

16 PCR-SSOP Amplificación del locus HLA por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con la subsiguiente hibridación del producto amplificado por medio de sondas de oligonucléotidos de secuencia específica.

subsiguiente hibridación del producto amplificado por

17 PCR - SSOP Amplificación: Pares de primers que amplifican locus HLA específicos marcados c/ biotina Primers genéricos Primers group/allele específicos Hibridización: DNA amplificado se desnaturaliza y se hibridiza con las sondas de secuencia complementaria a una temperatura y condiciones estrictas de astringencia Resultados: Se incuba las tiras con conjugado estreptavidina y peroxidasa que se une a la biotina y con el agregado de un sustrato se visualizan las bandas La tipif HLA es deducida a partir del patrón de reacciones positivas y negativas de la sondas

condiciones estrictas de astringencia Resultados: Se incuba las tiras con conjugado estreptavidina y peroxidasa que se une a la biotina y

18 SSOP Reversa Reporter Strepavidin Biotin 5 3 Amplified test DNA 3 5 Probe Support Platforms Nylon membranes Nitrocellulose strips Microtiter plates Luminex beads Microchips Reporter Molecules Fluorescent labels Enzyme + substrate

Nitrocellulose strips Microtiter plates Luminex beads

20 LUMINEX LABType SSO

21 Fundamento: 100 beads ópticamente distinguibles por el luminex unidas a sondas específicas que hibridizaran con el alelo específico en caso de estar presente. Using This Method and Two Dyes, 100 Individual Beads can be Resolved

23 LABTipe SSO 1) Amplificación con primers biotinilados. 2) Desnaturalización. 3) Hibridización con las beads. 4) Agrego SAPE (Estreptoavidina + ficoeritrina) para amplificar la señal. 5) Lectura en Luminex. 6) La asignación de la tipificación de HLA se basa en el patrón de reacción comparado con patrones asociados a secuencias de genes HLA publicadas

24 Description of LABType SSO 1. Amplification 2. Denaturation/Neutralization Class I 2/3 Class II - 2 primers 10 min biotina 3. Hybridization 4. Labeling 5 min a 60ºC washes

25 Probes are attached to color-coded beads Probe Probe 2 Probe

26 Biotin Signal Detection 1. Add DNA Biotin DR15 Probe DR16 Probe

27 2. Hybridize & Wash

28 3. Label with Stretavidin-PE SAPE Positive Negative

29 4. Fluorescence Measurement Fluorescence from 1. Reporter 2. Bead

33 SBT: Tipificación n basada en secuencia

34 SBT: Tipificación basada en secuencia El DNA se amplifica con una mezcla de nucleótidos marcados con 4 fluoróforos (Didesoxinucleótidos)

35 Como "molde" se utiliza una de las cadenas del fragmento de ADN que se va a secuenciar. Como "cebador" para iniciar la síntesis, se necesita un corto oligonucleótido complementario del extremo de la cadena. desoxinucleótidos de las cuatro bases: damp, dtmp, dgmp, dcmp. didesoxinucleótidos de una base en cada una de las cuatro reacciones de secuenciación. Al añadir la ADN-polimerasa, comienza la polimerización en el cebador, pero cesa el incorporarse un didesoxinucleótido

37 electroforesis. Identificados con un detector de fluorescencia automatizado Los fragmentos resultantes se separan por tamaño mediante electroforesis y la sucesión de bandas de cada una de las cuatro reacciones, comparándolas entre sí,dan la secuencia del ADN

41 Resumen SSP Primers de secuencia específica PCR/electroforésis en gel de agarosa Media Rápida SSOP REVERSA Sondas de oligonucléotidos específicas a secuencia PCR/hibridación de sondas con producto de la PCR Media/alta + prolongada LUMINEX Sondas de oligonucléotidos específicas de secuencia unidas a microesferas PCR/hibridación de sondas con producto de la PCR Media o alta Análisis múltiples con sensibilidad de Citometría de flujo Análisis automatizado estudian 96 indiv.con 100 diferentes sondas x locus Rápido,> nº de muestras SBT Cebadores de sitio específicos a grupo y mezclas de establecimiento de secuencia con un teminador de secuencia marcado PCR/establecimiento de secuencia del producto de la PCR Alta Alelos a nivel de secuencia exacta

42 HLA Alleles and Antigens (IMGT)

43 Numero de antígenos y alelos nombrados por el comité de nomenclatura HLA desde 1968 hasta junio del 2010.

44 Assigned April 2010

45 Assigned April 2010 Las reglas para nombrar los antígenos HLA y alelos son establecidos por un Comité de Nomenclatura de la WHO (World Health Organization) (Marsh SG, et al. Immunol.2005 Humanos; 66:571 )

46 Assigned April 2010

47 Códigos NMDP( National Marrow Donor Program)

48 Resolución en HLA Typing Baja resolución molecular. Tipificación se resuelve o se reporta en un nivel de 2 digitos A*02-B*08-DRB1*03 Equivalente a la tipif. serológica Resolución molecular intermedia Tipificación se resuelve o se reporta como un set de posibles alelos A*02DEKM, 24DEKN 51 posibles A*02 allelos y 42 posibles A*24 allelos. Alta resolución molecular Tipificación se resuelve o se reporta como un único alelo A*01:02:01 Ventajas de los ensayos moleculares Mayor precisión y reproducibilidad No hay necesidad de linfocitos viables Opción para la automatización parcial o total

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