C V C. Instrucciones de uso de Biofortuna SSPGo TM HLA No Template Control Kit BF Revisión 2. Julio de 2014

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2 DOT142v1 Instructions for Use Biofortuna SSPGo TM HLA No Template Control Kit BF Página 2 de 7 1. Finalidad de uso El equipo Biofortuna SSPGo No Template Control (NTC) (control negativo) contiene pruebas suplementarias para detectar contaminaciones por amplicones de PCR para su uso con los equipos Biofortuna SSPGo que no disponen de un control negativo integrado. 2. Introducción La PCR es una técnica sensible que es susceptible a la contaminación por amplicones de DNA de otra PCR anterior. La contaminación puede dar lugar a falsos positivos para la amplificación en PCR posteriores y, por tanto, dar genotipos incorrectos. El amplicón de PCR puede contaminar los reactivos y las muestras, así como los materiales de laboratorio como las pipetas. Los reactivos y los materiales deben vigilarse con regularidad para detectar posibles indicios de contaminación. El análisis con NTC se usa para detectar la posible presencia de contaminación en la PCR o de contaminación del DNA presente en el diluyente de DNA utilizado para analizar una muestra. 3. Descripción del ensayo Cada equipo SSPGo No Template Control está formado por 12 tiras de 8 tubos para PCR que contienen liofilizados de tampón para PCR, polimerasa y cebadores específicos para el gen HLA-DRA y producirán un amplicón de 187 bp del DNA genómico humano o DNA amplificado. Todos los equipos Biofortuna utilizan un amplicón DRA como control interno. Por lo tanto, si se produce alguna contaminación con los equipos Biofortuna SSPGo se producirá una coamplificación de gen DRA y será detectado por los cebadores para detectar la contaminación del ensayo. 4. Contenido del equipo 12 tiras de 8 tubos para PCR, cada una con 10 µl de cebadores, polimerasa, dntps* y tampón liofilizados predispensados. A continuación se muestra la estructura de la tira de reacción de ocho reacciones. Reacción Colorante Uso 1 Rojo Control negativo: Muestra 1 2 Violeta Control negativo: Muestra 2 3 Violeta Control negativo: Muestra 3 4 Violeta Control negativo: Muestra 4 5 Violeta Control negativo: Muestra 5 6 Violeta Control negativo: Muestra 6 7 Violeta Control negativo: Muestra 7 8 Violeta Control negativo: Muestra 8 12 x 8 tapones para PCR 1 x Instrucciones de uso 1 x Certificado del análisis Las fichas de datos de seguridad (MSDS) pueden descargarse de la página web de Biofortuna Si por algún motivo no puede descargar la información de la página web, póngase en contacto con su distribuidor local. *CleanAmp dntps disponen de autorización de Trilink Biotechnologies Inc para su utilización con los productos Biofortuna SSPGo.

3 DOT142v1 Instructions for Use Biofortuna SSPGo TM HLA No Template Control Kit BF Página 3 de 7 5. Reactivos y materiales no suministrados Pipetas calibradas y puntas esterilizadas adecuadas, por ejemplo, pipeta P10 con puntas con filtro de 10 µl. Equipo/material de extracción de DNA. Espectrofotómetro UV. Tubos de polipropileno. Agua grado biología molecular estéril. Deberá emplearse un termociclador con las siguientes características: Termociclador de 96 pocillos con tapa térmica y temperatura de 104 o C para el funcionamiento sin aceite Tasa de rampa de 1.0 o C/seg Rango de temperatura de 4,0 C a 99,9 C Exactitud de la temperatura ±0,25 C Calibración de la temperatura rastreable respecto a una referencia estándar Programación del ciclo térmico a través de los parámetros de ciclo recogidos en el apartado 8 que aparece a continuación Advertencia: Para información concreta sobre el termociclador, consulte el manual del usuario del fabricante. El termociclador deberá ser calibrado según las normas de acreditación de la Sociedad American de Histocompatibilidad (ASHI) o de la Federación Europea de Inmunogenética Los reactivos de electroforesis en gel (agarosa, TBE 0,5x, marcador de peso molecular para DNA 1000 bp, bromuro de etidio 10 mg/ml). Equipo de electroforesis en gel (soportes de gel, suministro eléctrico, sistema de documentación del gel con transiluminador UV). Nota: Los cambios en las condiciones especificadas como las tasas de rampa de los termocicladores podrán afectar a la interpretación de los resultados de los ensayos. 6. Advertencias y precauciones Los ensayos deben ser realizados únicamente por personal con la formación adecuada. Maneje los reactivos de acuerdo con las buenas prácticas de laboratorio. Mantenga las áreas destinadas a los pasos pre-pcr y pos-pcr separadas. No devuelva ningún material del área pos-pcr al área pre-pcr. Advertencia de riesgo biológico: maneje todos los productos sanguíneos como potencialmente infecciosos. Advertencia de riesgo biológico: el bromuro de etidio es un carcinógeno potencial. Si lo usa, hágalo siempre con guantes, bata de laboratorio y gafas protectoras. Advertencia de riesgo biológico: tome precauciones cuando use una fuente de luz UV. Use siempre guantes, bata de laboratorio y gafas protectoras. No mire nunca la fuente de luz UV directamente. Las fichas de datos de seguridad se encuentran disponibles en 7. Almacenamiento y estabilidad Los equipos Biofortuna SSPGo deben almacenarse a una temperatura entre 2 C y 28 C. Una vez que las placas con los pocillos de PCR son extraídas de las bolsas metalizadas, los reactivos deben rehidratarse con DNA en las siguientes 3 horas. Consulte la fecha de caducidad en el envase. No utilice los productos una vez transcurrida la fecha impresa. No utilice los equipos si la bolsa metalizada está rasgada o perforada o si no incluye una bolsa anticondensación Utilizar únicamente las hojas y los tapones de sellado suministrados, y asegurarse de que las placas con los pocillos de PCR están bien selladas una vez que añada DNA, ya que podría evaporarse durante la amplificación de la PCR. Preste especial atención a los bordes y a las esquinas.

4 DOT142v1 Instructions for Use Biofortuna SSPGo TM HLA No Template Control Kit BF Página 4 de 7 Nota (1): Si fuera necesario, las placas y las tiras no hidratadas fuera de la bolsa podrán mantenerse a una temperatura máxima de 21 o C y a una humedad no superior al 60% durante hasta 3 horas. Nota (2): Una vez hidratadas con ADN, las tiras y placas de la PCR de las bolsas recién abiertas pueden almacenarse durante un máximo de 24 horas a 2 8 C antes del paso de la PCR, siempre que los pocillos estén bien sellados para evitar la evaporación. 8. Instrucciones de uso Nota: Las pipetas que se usan para la PCR son una fuente frecuente de contaminación. Se recomienda usar una pipeta que se haya comprobado que no esté contaminada para cargar la muestra en las reacciones para PCR, incluido este análisis del NTC. 1. Abra la bolsa metalizada e identifíquelas debidamente con etiquetas; una tira puede usarse para analizar entre una y ocho muestras. Una vez abierta, los tubos con las reacciones de PCR deben usarse en las 3 horas siguientes. 2. Para cada muestra de DNA añada 10 µl de agua o diluyente a una de las reacciones de la tira de NTC. 3. Si se requiere un control positivo use 10 µl de DNA genómico humano a una concentración de 10 ng/µl. Esto tendrá como resultado un producto amplificado positivo de 187 bp. 4. Tape las reacciones con los tapones suministrados y continúe con los parámetros de PCR SSPGo que se muestran a continuación. NOTA SOBRE LA RESUSPENSIÓN: asegúrese de que las mezclas de PCR se hayan resuspendido con las muestras en las 3 horas siguientes después de retirar los tubos de la bolsa metalizada. NOTA SOBRE LA ALTURA DE LA PLACA/TIRA DE PCR: se recomienda que la altura de las placas y las tiras con tubos para PCR sea equivalente cuando se colocan en el mismo aparato de PCR. Alturas diferentes pueden causar un mal contacto con la tapa térmica de los aparatos de PCR. Esto podría provocar que la amplificación de la PCR sea mala o errónea. Parámetros de la PCR Se debe usar el siguiente perfil térmico para PCR. Asegúrese de que la velocidad de la rampa es de al menos 1 C por segundo y de que está colocada la tapa térmica. Para obtener información detallada, consulte las instrucciones de uso del fabricante del termociclador. Los termocicladores deben calibrarse de acuerdo con las normas de la Sociedad Americana de Histocompatibilidad e Inmunogenética ( American Society of Histocompatibility and Immunogenetic, ASHI) o la Federación Europea de Inmunogenética (European Federation of Immunogenetics, EFI). Desnaturalización 94 C 5 minutos Desnaturalización 96 C 15 segundos Hibridación (anneal) 66 C 50 segundos 10 ciclos Extensión 72 C 30 segundos Desnaturalización 96 C 15 segundos Hibridación (anneal) 64 C 50 segundos 20 ciclos Extensión 72 C 30 segundos MANTENER 15 C Electroforesis en gel Estas instrucciones se aplican a la electroforesis horizontal en gel de agarosa: prepare un gel de agarosa al 2% en tampón TBE 0,5x. Cuando el gel se enfríe a una temperatura de unos 60 C, añada bromuro de etidio hasta obtener una concentración final de 0,5 µg/ml. Vacíe el gel en un molde e introduzca el peine para formar pocillos (por ejemplo, un peine con pocillos 12x8 y separados 9 mm un pocillo de otro). Una vez solidificado el gel, retire el peine

5 DOT142v1 Instructions for Use Biofortuna SSPGo TM HLA No Template Control Kit BF Página 5 de 7 y cubra el gel con tampón TBE 0,5x. Transfiera un mínimo de 5 µl y un máximo de 10 µl de cada pocillo de placa o tubo de tira de reacción al pocillo correspondiente sobre el gel; anote la posición de cada muestra de reacción. Un marcador de 100bp puede ser útil para determinar el tamaño. Someta el gel a 10 V/cm durante 20 minutos. Para obtener información sobre los detalles de los equipos, consulte las instrucciones del fabricante del sistema de electroforesis. La imagen del gel se debe visualizar con un sistema de documentación de gel UV con transiluminador de UV. 9. Interpretación Registre los resultados en la tabla de registro de la muestra de la página 6 de estas instrucciones de uso. Se debe observar un amplicón de 187 bp si hay contaminación de la PCR SSPGo o contaminación del DNA. Cualquier mancha o banda de tamaño diferente también puede indicar contaminación de la PCR, pero no deben tenerse en cuenta los dímeros de cebadores y otros artefactos de los cebadores de menos de 100 bp. Un resultado positivo para cualquier muestra indica que el genotipo de esa muestra no es válido y debe repetirse con otra muestra de DNA usando reactivos diferentes. 10. Aseguramiento de calidad y control Análisis del ensayo: con producto amplificado de PCR de un equipo Biofortuna, la prueba NTC se realizó sobre un amplicón sin diluir y posteriormente en diluciones de 1x10 1 a 1x El producto amplificado se detectó en diluciones de hasta e incluido 1x La prueba NTC se realizó sobre gdna a 100 ng/µl y después en diluciones de 1x10 1 a 1x El DNA se detectó en diluciones hasta de 1x Bibliografía 1) Bunce M et al Tissue Antigens Nov;46(5): ) Saiki RK et al. Nature Nov 13-19;324(6093):163-6.

6 DOT142v1 Instructions for Use Biofortuna SSPGo TM HLA No Template Control Kit BF Página 6 de Hoja de datos de las muestras para Biofortuna NTC Test Esta hoja debe fotocopiarse antes de ser usada ya que el equipo NTC contiene suficientes análisis para 96 muestras (doce tiras de ocho tubos para PCR). Descripción de la muestra 1. Descripción de la muestra 2. Descripción de la muestra 3. Descripción de la muestra 4. Descripción de la muestra 5. Descripción de la muestra 6. Descripción de la muestra 7. Descripción de la muestra 8. Registro de la muestra para NTC Reacción Colorante ID de la muestra Fecha de análisis Resultado 1 Rojo 2 Violeta 3 Violeta 4 Violeta 5 Violeta 6 Violeta 7 Violeta 8 Violeta

7 DOT142v1 Instructions for Use Biofortuna SSPGo TM HLA No Template Control Kit BF Página 7 de Símbolos utilizados X Número de análisis P Representante de la Comunidad Europea Consultar las instrucciones de uso i M V H Lugar de fabricación Diagnóstico in vitro Fecha de caducidad 4: s 28: Temperatura de almacenamiento g Número de lote Distribuido por Número Mundial de Artículo Comercial 14. Datos del fabricante Biofortuna Ltd 1 Hawkshead Road Croft Business Park Bromborough, CH62 3RJ, UK T: +44 (0) E: W: Traducciones FranÇaise: Deutsch: Español: Italiano: České: Danske: Έλληνες: Magyar: Norske: Polska: Português: Россию: Slovenskému: Türk: Svenska: Traductions disponibles Übersetzungen verfügbar Traducciones disponibles Traduzioni disponibili Překlady k dispozici Tilgængelige oversættelser διαθέσιμες μεταφράσεις Fordítások Oversettelser tilgjengelig Dostępne tłumaczenia Traduções disponíveis Переводы доступны Preklady k dispozícii Çeviriler mevcut Översättningar tillgängliga

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