Guía del Curso. Biología Molecular aplicada al Diagnóstico

Transcripción

1 Guía del Curso Biología Molecular aplicada al Diagnóstico UCA

2 Índice Tecnología del ADN recombinante 3 Qué es clonar? 3 Pasos para llevar a cabo una clonación de un gen 3 Desarrollo 4 Otras enzimas utilizadas en tecnología recombinante 9 Vectores recombinantes Identificación de ácidos nucleicos 13 Reacción en cadena de la polimerasa o PCR 13 Pasos de la PCR 14 Usos de la PCR 15 Secuenciación 20 Secuenciación manual 21 Secuenciación automática 21 Hibridación 21 Marcado de Sondas 22 Tipos de hibribación 22 2

3 Parte I 1- Tecnología del ADN recombinante Qué es clonar? -Utilizar tecnología de ADN especializada o tecnología recombinante para producir múltiples copias exactas de un gen u otro segmento de ADN. -ADN cromosomal eucariótico o procariótico que se inserta en diferentes células huésped utilizando su maquinaria de replicación. Objetivo: obtener suficiente material a estudiar. ADN: material genético de la célula que consiste en un polímero de nucleótidos conectados a través de un esqueleto del azúcar fosfatodesoxirribosa. Gen: Unidad de herencia formado por un segmento de ADN que contiene la información necesaria para la síntesis de una proteína. Pasos para llevar a cabo una clonación de un gen: 1- Extracción del ADN genómico total o del ADN plasmídico. 2- Recuperación del fragmento de interés a partir de ADN genómico. 3- Digestión (corte) del ADN doble cadena (ADNdc). 4- Digestión y desfosforilación del vector de clonado o expresión. 5- Ligación de los ADNdc. 6- Inserción de los productos ligados en la célula. 7- Selección de colonia conteniendo el clon buscado. 3

4 Desarrollo 1- La extracción del ADN genómico total permite la adquisición de todo ADN dentro de la célula, ya sea cromosómico como extracromosómico (por ej.: plasmídico). Es importante trabajar con todo el ADN si no se sabe donde se localiza el fragmento de interés. La extracción del ADN plasmídico se utiliza para obtener solamente los plásmidos que contiene una célula. Este protocolo se utiliza para obtener grandes cantidades del vector seleccionado para la clonación. 2- Existen diferentes métodos para la recuperación del fragmento de interés. En la mayoría de las situaciones, no se conoce la localización, es por ello que se debe trabajar con el ADN total. Método clásico: Este método es más largo e involucra varios pasos y técnicas diferentes. El ADN total debe ser digerido (cortado) por una enzima de restricción endonucleasa. Este enzima debe ser la misma que se utilizará para digerir más adelante el vector (plásmido donde se insertará el fragmento). Una vez digerido el ADN total, se migrará en un gel de agarosa, el cual al ser revelado con bromuro de etidio y luz ultravioleta mostrará un chorreado. Este chorreado es la causa de que las enzimas endonucleasas poseen varios sitios de corte en un genoma completo. Figura 1. Gel mostrando la restricción de ADN total Calle 1: Marcado de peso molecular Calle 2: ADN total sin digerir Calle 3: ADN total digerido 4

5 Nota: una endonucleasa puede cortar 1 vez en 4kb (tamaño de un vector); los genomas tienen aproximadamente 4000kb, por ende puede haber mínimamente 1000 sitios de corte. Una vez digerido el ADN total, se debe ubicar la región del chorreado donde está el gen. Para ello se llevará a cabo una hibridación mediante la transferencia del ADN total digerido a una membrana de nitrocelulosa o nylon. El ADN total digerido que se encontraba simple cadena fue desnaturalizado (separación de las hebras) generando el ADN simple cadena. Este ADN simple cadena será fijado en la membrana para que pueda luego hibridarse con sondas radiactivas o no radiactivas (técnica de Southern blot). 5

6 El ADN marcado con sondas será detectado y permitirá saber el tamaño del fragmento de interés. En un nuevo gel, se migrará una nueva muestra del ADN total digerido. A la altura del tamaño del fragmento, ya conocido por la hibridación, se cortará el gel y se eluirá el ADN del mismo. Al final, se obtendrá un ADNdc que contiene el fragmento de interés puro con los extremos ya listos para la inserción en un vector. Método moderno: La recuperación de un gen de interés mediante este método requiere conocer la secuencia completa del mismo y/o sus regiones adyacentes. En un primer lugar, se diseñarán primers (cebadores) que abarcan desde el primer hasta el último nucleótido del gen (en el caso de estudiar o desear la expresión de una proteína). Estos primers pueden llevar en su secuencia adicionados en el extremo 5 los sitios de restricción que reconocen las endonucleasas. Se amplificará el fragmento de interés a partir del ADN total mediante PCR utilizando los primers diseñados. La ADN polimerasa utilizada para la reacción de PCR deberá ser de bajo error de replicación, como la Pfu o la Pfx, a fin de evitar mutaciones en el fragmento estudiado. Se purificará el producto de la amplificación y se digerirá con la enzima seleccionada (endonucleasa que reconoce los sitios adicionados y que corresponde a la misma enzima que se utilizará para digerir el vector). Al final, se obtendrá un ADNdc que contiene el fragmento de interés puro con los extremos ya listos para la inserción en un vector, en menor tiempo. 5- En este paso deberá elegirse que tipo de vector se va a utilizar. Si se desea estudiar un fragmento de ADN que no implica la síntesis proteica, se puede utilizar un vector de clonado. Si es necesaria la síntesis proteica, deberá utilizarse un vector de expresión. Los vectores de clonado son moléculas de ADN extracromosómicas que permiten la replicación de un fragmento de ADN. Estos vectores poseen 6

7 sitios de restricción dispersos a lo largo de su secuencia, marcadores de selección (genes de resistencia a antibióticos, genes para la degradación de nutrientes, etc) y un origen de replicación (oriv). Los vectores de expresión poseen las mismas propiedades que los vectores de clonado, pero los sitios de restricción están generalmente ubicados en sitios de clonación múltiples (MCS o polilinkers) río abajo de una región reguladora (promotor) inducible. Además del marcador de selección, pueden contener otros genes que permiten realizar un screening previo (por ejemplo, gen lacz, el cual identifica a las colonias que contienen el fragmento de interés clonado con color blanco de aquellas colonias que no lo tienen, de color azul). Si se desea trabajar con un gen clonado en un vector en diferentes sistemas celulares, se deberá seleccionar un vector shuttle. Estos vectores poseen la información necesaria para su replicación (origen) y para la selección en diferentes tipos de células. Una vez elegido el vector al cual se le insertará el fragmento de interés. Se deberá extraer el ADN y digerirlo con la misma enzima de restricción que se utilizó para digerir el ADN total (paso 2). Antes de ligar los ADNs, el vector deberá ser defosforilado con la enzima Fosfatasa Alcalina. Esta enzima elimina el grupo fosfato del extremo 5 del ADNdc. Este paso asegura que los extremos del vector no vuelvan a unirse cuando se pongan en contacto con la ligasa, aumentando la recuperación de la unión entre el vector con el fragmento de interés. 6- Una vez listos el ADN del vector y del inserto, se procederá a ligarlo con la enzima ligasa. Esta enzima require que al menos uno de los extremos 5 posea el grupo fosfato. Como el vector fue defosforilado, solamente es posible la ligación vector-inserto o inserto-inserto. Como el vector posee la 7

8 maquinaria de replicación y selección en la célula, será solamente seleccionadas las bacterias que contengan la combinación vector-inserto. 7- Los productos de la ligación serán insertados en las bacterias mediante el método de electroporación (método físico que involucra un pulso eléctrico) o por método químico de transformación (células con la pared debilitada). Solo algunas bacterias podrán adquirir las moléculas ligadas. Para discriminar aquellas células que poseen dichas moléculas de las que no las poseen, se utilizará medio sólido adicionados con el marcador que aporta el vector (antibiótico o nutriente) durante el crecimiento. 8

9 Otras enzimas utilizadas en tecnología recombinante: Nucleasas Endonucleasas Sitio específicas: son enzimas llamadas comúnmente de restricción. Estas enzimas cortan uniones fosfodiester de generando extremos romos o cohesivos. Como condición para llevar a cabo el corte del ADN, estas enzimas requieres de una secuencia específica. 5 cohesivo 3 cohesivo romo Endonucleasas No Sitio específicas: Hay diferentes tipos de enzimas que cortan en uniones fosfodiester al azar en ADN simple o doble cadena, en ARN simple o doble cadena, así como Exonucleasas Corta los ácidos nucleicos doble o simple cadena sólo por los extremos, como por ejemplo, la actividad de proofreading durante la replicación del ADN. 9

10 Polimerasas: son las enzimas encargadas de la síntesis de ácidos nucleicos mediante la adición de nucleótidos en sentido 5 3. Existen dos grupos: las ADN polimerasas y las ARN polimerasas. Las ARN polimerasas son las encargas de sintetizar el ARN mensajero. Requieren de un promotor y de un factor transcripcional para iniciar la síntesis. Las ADN polimerasas son las encargas de sintetizar el ADN durante la replicación. En este grupo se encuentras las polimerasas termoestables, las cuales gracias a su capacidad de tolerar altas temperaturas son utilizadas en la técnica de PCR. Kinasas: son enzimas que adicionan grupos fosfato a los extremos 5 del ADNdc. Estas enzimas son utilizadas para el marcado radiactivo de sondas para ser utilizadas en diferentes técnicas, como ser en la hibridación. Metilasas: son enzimas que digieren todo ADN que posee las adeninas o los citosinas metiladas. Este enzima se lo utiliza para separar el ADN sintético de aquel extraído de una célula, ya que estas últimas protegen su ADN mediante la metilación. Vectores recombinantes Un vector es un agente que puede insertar un fragmento de ADN dentro de una célula huésped. Los vectores se clasifican según la célula a la cual serán insertados: Bacterianos: plásmidos, fagos, cósmicos, BAC. Eucarióticos: plasmídicos, virales, integrativos, lineales, YAC. Plásmidos (ver pág. 6-7) 10

11 Permiten la inserción de hasta 12kb de un fragmento de ADN. Es el sistema más común, el cual debe contener al menos un marcador de selección y un origen de replicación (oriv). Los plásmidos pueden ser de alto o bajo número de copias. El número de copias es indicativo de la cantidad de moléculas que hay de cada plásmido en una bacteria. Los vectores plasmídicos deben insertarse en una célula bacteriana mediante la transformación química (menos efectivo) o la electroporación (más efectivo pero más agresivo). Fagos Los fagos o bacteriófagos son virus que infectan células bacterianas. Existen dos tipos principales de fagos utilizados en tecnología recombinante, los filamentos o los de Tipo 1 (T1). A diferencia de los plásmidos pueden adquirir hasta 23kb de un fragmento exógeno e insertarlo en una bacteria, mediante el evento de transducción. Este evento le provee a los fagos una mayor eficiencia en la inserción de material genómico en una bacteria, con respecto a los plásmidos. Al infectar el fago la bacteria, su material genómico podrá integrase al genoma de huésped, aprovechando la capacidad lisogénica de los virus. Cósmidos Los cósmidos fueron sintetizados en el laboratorio aprovechando las propiedades de los plásmidos y los fagos. Su propagación es similar a la de un plásmido pero utilizan la transducción para la inserción del material genético, ya que contienen la información necesaria para infectar la célula y sintetizar su envoltura al igual que los fagos. Los cósmidos permiten insertar hasta 45kb de un fragmento exógeno. 11

12 BAC (bacterial artificial chromosome) Los BAC son vectores sintéticos que simulan cromosomas bacterianos y permiten introducir hasta 350kb de un ADN externo. Celulas huésped Existen diferentes tipos de células huésped para el estudio de ADN, ARN y/o proteínas provenientes de diferentes sistemas, ya sean procarióticos o eucarióticos. Entre los sistemas procarióticos de referencia desarrollados se encuentran E. coli o P. aeruginosa para bacterias gram negativas, o Bacillus subtilis, S.aureus, Streptommyces para bacterias gram positivas. Estas células huésped son utilizados generalmente para el estudio del material genético de bacterias, virus o levaduras. En el caso de los sistemas eucarióticos, las células utilizadas en tecnología recombinante son Saccharomyces cereviseae y Pichia pastoris para levaduras, o diferentes lineas célulares mamíferas. Aún cuando en muchos casos se puede utilizar sistemas bacterianos, la célula huésped debe ser aquella que posea una funcionalidad igual o similar al sistema original de donde proviene el material genético a estudiar. Por otro lado, debe tenerse en cuenta que existe varias diferencias en la síntesis de proteínas en eucariotas y procariotas. La utilización de sistemas diferentes puede llevar a una alteración en la interpretación ya que estas condiciones no equivalen en las condiciones reales. 12

13 PARTE II 1- Identificación de ácidos nucleicos Existen diferentes métodos para la identificación de ácidos nucleicos. Entre ellos, la técnica de PCR, la secuenciación automática y la hibridación son los más comunes. Reacción en cadena de la polimerasa o PCR La PCR consiste en la amplificación de material genético (ADN o ARN) con secuencias nucleotídicas únicas y presentes en cada especie Permite caracterizar, analizar y sintetizar cualquier fragmento de ADN o ARN. Es una metodología rápida, barata y simple para producir grandes cantidades de copias de un fragmento de ADN o ARN (aún cuando la calidad y cantidad sean pobres). Para realizar una PCR es necesario adicionar: -ADN templado o molde: Este ADN puede ser total o plasmídico y debe estar puro. -dntps: desoxirribonucleótidos. -Primers (2): Los primers son fragmentos de ADN simple cadena de aproximadamente 25 nucleótidos de largo que se aparean específicamente con el ADN templado. 13

14 -ADN polimerasa termoestable: Las polimerasas son enzimas que sintetizan el ADN utilizando un molde incorporando un dntp a la vez, manteniendo la complementariedad A:T y G:C. Existen diferentes tipos de enzimas según su funcionalidad: Las polimerasas con baja relación de error, que son ideales para amplificar producto que luego serán clonados en un vector (Pfu o Pfx). Las polimerasas con elevada robustez, que permite amplificar productos de mayor longitud. Las polimerasas de bajo costo, utilizadas generalmente para la detección de fragmentos de ADN y estudios epidemiológicos (Taq). -Mg 2+ : sal de cloruro o sulfato de magnesio. El catión Mg 2+ es necesario para la funcionalidad de la ADN polimerasa ya que actúa como co-factor de la enzima. Pasos de la PCR Hay tres pasos básicos en la reacción de amplificación: 1- Desnaturalización del ADN templado por calor. Durante este paso, se calientan las muestras a 94 C durante 5 min aproximadamente. 2- Apareamiento del ADN con los primers. Este paso, se realiza a una temperatura de apareamiento que depende del largo y cantidad de G y C del primer. Dichas propiedades son tenidas en cuenta durante el diseño de cada primer. En general, deben utilizarse temperaturas entre C. 3- Elongación del ADN. Este paso se lleva a cabo a 72 C, que corresponde a la actividad óptima de funcionamiento de la Taq polimerasa. 14

15 Para llevar a cabo la detección de los productos de la amplificación por PCR, se debe migrar una alícuota de la reacción en un gel de agarosa con bromuro de etidio y exponer a luz ultravioleta. Usos de la PCR Diagnóstico Biología Molecular Estudios Evolutivos de ADN ancestros Sistemática Moderna Estudios Ecológicos Comportamiento Animal Proyectos Genoma Genética Forense Hay muchos tipos de PCR y a medida que avanza la tecnología se van renovando. Aún así, el principio sigue siendo el mismo. Entre las PCR más comunes se encuentran las siguientes: -Hot Star PCR: Esta PCR utiliza los mismos reactivos que la PCR Standard. A diferencia de la PCR Standard, en la cual la polimerasa se adiciona al preparar la mezcla de reactivos, en la PCR Hot Star la enzima se adiciona luego, cuando la reacción ya se encuentra a 95C. Esta modificación permite 15

16 aumentar la especificidad de la reacción, eliminando la cantidad de producto no deseado y aumentando la cantidad de producto deseado. -PCR Multiplex: Esta PCR se caracteriza por lograr la amplificación de varios productos en una misma reacción. Para ello, se utilizan las condiciones de la PCR Standard con la diferencia que en este caso se adicionan varios pares de primers (hasta 5 pares), en vez de un solo para de primers. Este tipo de PCR es ideal para el diagnóstico rápido ya que permite detectar varios genes de interés a partir de una sola muestra. A su vez, tiene como desventaja que la puesta a punto de la técnica es larga, e inclusive puede no se lograda, ya que puede dar fácilmente falsos positivos. Estos falsos positivos son causados por la alta variedad de combinaciones posibles que proveen los primers. -Nested PCR: Esta PCR consiste en la utilización de dos pares de primers que serán adicionados secuencialmente. En un primer paso, se realizará una PCR Standard durante los primeros ciclos. Luego, un segundo par de primers será adicionado a la reacción. Este nuevo par de primers deberán ser 16

17 internos, es decir que deberán aparearse en el ADN templado o molde unos residuos más adentro del gen de interés. Esta PCR se lo utiliza generalmente para incrementar la cantidad del producto de amplificación y la especificidad de la reacción. Primer par de primers (externos) Segundo par de primers (externos) -Touchdown PCR: Esta PCR utiliza las mismas condiciones que la PCR Standard. En este caso la modificación ocurre en los ciclos utilizados. A diferencia de llevar a cabo un paso de apareamiento a una misma temperatura, en esta PCR se va reduciendo 1C en cada ciclo. Por ejemplo, si la PCR posee una temperatura de 60C de apareamiento en el ciclo 1, la misma será de 59C en el 2, 58 en el 3, 57 en el 4, y así sucesivamente. Esta modificación le provee a la PCR una mayor especificidad. -AFLP PCR (Amplified Fragment Length Polymorphisms-PCR): Esta PCR requiere la utilización del ADN total, el cual será digerido con una enzima de restricción. Una vez llevado a cabo este paso, se deben adicionar mediante la ligación con la enzima Ligasa (ver Otras enzimas Parte I) unos fragmentos de ADN doble cadena llamados adaptadores, que proveen la secuencia nucleotídica que será reconocida por los primers utilizados en la reacción de amplificación. De esta forma, se obtendrán fragmentos de diferentes 17

18 tamaños, que le darán a cada organismo un patrón de bandas. Esta PCR se la utiliza como aproximación para determinar la clonalidad de los organismos. PCR inversa Amplifica secuencias desconocidas Fragmento conocido 1 paso: digestión con enzima de restricción Los primers se dirigen hacia afuera de la región conocida 2 paso: ligación Fragmento conocido 3 paso: PCR y luego secuenciación -PCR inversa: La PCR inversa utiliza los mismos reactivos y las mismas condiciones que la PCR Standard. La única diferencia consiste en diseñar primers que se direccionan hacia fuera del gen o fragmento de interés, para lograr obtener las regiones adyacentes al mismo. Como paso previo para esta técnica, se debe extraer el ADN total, digerirlo con una enzima de restricción con varios sitios de corte y luego ligar al azar todo el ADN. Esta ligación al azar generará fragmentos circulares de ADN que tendrán un menor tamaño y podrán ser amplificados mediante una PCR. Esta PCR se utiliza para conocer las regiones donde se localizan o que rodean al gen de interés. -RT-PCR: Esta PCR es la combinación de dos reacciones. La primera consiste en obtener el ADN copia a partir de un ARN utilizando la ADN polimerasa transcriptasa reversa. Para ello, se debe extraer el ARN total de la célula y combinarlo con un primer específico o random junto con dntps y la enzima. Una vez obtenido el ADN copia, se procede con la PCR en condiciones 18

19 Standard. La sola presencia de un gen no es indicativo que exista la síntesis de una proteína. Es necesario que haya una región reguladora que permita la transcripción y una región de unión al ribosoma para lograr la síntesis proteica. Esta técnica permite conocer si un gen se transcribe o no en la célula. En el caso de combinarlo con un equipo para una PCR real time, se puede inclusive cuantificar dicha transcripción. La RT-PCR tiene como desventaja que el ARN debe estar muy puro y no arrastrar contaminación con ADN, lo cual la vuelve laboriosa. -RACE-PCR: Así como en la RT-PCR, esta PCR combina de la síntesis del ADN copia a partir de un ARN utilizando la ADN polimerasa transcriptasa reversa, seguida por la amplificación del producto por PCR. A diferencia de la RT-PCR, la RACE adapta la técnica para lograr obtener los extremos de los ARN mensajeros. En el caso del extremo 5, una vez obtenido el ADN copia se sintetiza una cola de poli A con la enzima terminal transferasa. Luego se continúa con la PCR utilizando un primer complementario a la cola polia, formado por una secuencia poli T. En el caso del extremo 3, se sintetiza el ADN copia usando la cola de poli A adicionada naturalmente en dicho extremo. Luego se combinan primers específicos para la PCR Standard. 19

20 -PCR de colonia: Esta PCR utiliza los mismos reactivos que la PCR Standard a partir de una colonia. En este ensayo cada reacción corresponde a una colonia. Éstas serán hervidas para extraer todo el ADN y expuestas a condiciones Standard de PCR. La ventaja de esta técnica es una rápida detección de un gen para diagnóstico a una gran variedad de colonias en poco tiempo. -Real time PCR: La técnica de real time posee el mismo principio de la PCR pero con algunos reactivos diferentes y un equipo más avanzado. En primer lugar, se debe utilizar primer con fluoróforos que emitirán una luz fluorescente, la cual es detectada en la fase exponencial de la PCR. Esta detección temprana permite ahorrar mucho tiempo y obtener el resultado anticipadamente. A su vez, debido a que la emisión es proporcional a la cantidad de producto, esta técnica es utilizada para la cuantificación de los mismos. Por otro lado, también se puede diferenciar los alelos de una célula ya que cada uno de los productos posee una Tm diferente. Además del menor tiempo de obtención de los resultados, esta técnica tiene la ventaja de que puede ser adaptada para RT-PCR y Multiplex. Secuenciación Existen dos tipos de secuenciación. -Manual -Automatico Ambos utilizan el método de Sanger. 20

21 Secuenciación manual La secuenciación manual consiste en sintetizar el ADN utilizando la T7 polimerasa y tres especies de nucleótidos: los deoxinucleótidos (dntps), los dideoxinucleótidos (ddntps) y un dntp marcado para la deteción. Los dntps son los mismos que se utilizan para la amplificación en la técnica de PCR, mientras que los ddntps son modificaciones de los dntps, ya que carecen del grupo 5 fosfato necesario para continuar la síntesis de ADN. Al adicionarse al azar un ddntp a la hebra de ADN sintentizada para la reacción, permitiendo obtener fragmentos de diferentes largos. Cada uno de los ddntp (A, G, T o C) es adicionado en un tubo independiente para identificar cual fue el último nucleótido agregado en cada fragmento. Por último, la detección de los distintos fragmentos es lograda usando un dntp marcado radiactivamente. Secuenciación automática La secuenciación automática utiliza un equipo automatizado que permite en una misma corrida ensayar los cuatro ddntp utilizando fluoróforos. La utilización de este tipo de secuenciación tiene las siguientes ventajas: mayor resolución y secuenciación de hasta 96 muestras por corrida. El resultado de la secuenciación se obtiene en tres formatos: archivos pdf, archivos txt y archivos para ser utilizados con softwares específicos (archivos abi). Los archivos abi contienen el cromatograma, el cual permite evaluar la calidad de la secuenciación. Hibridación La hibridación es una técnica que permite detectar ácidos nucleicos utilizando secuencias cortas de ADN marcado. 21

22 Marcado de sondas El marcado puede ser radiactivo o no radiactivo. -Marcado radiactivo de sondas: se logra utilizando el radioisótopo 32P, el cual se compra adicionado a un datp (nucleótido de adenosina). Este nucleótido de datp conteniendo 32P es adicionado al extremo 5 del fragmento de ADN o sonda mediante la enzima T4 polinucleotido kinasa (ver kinasas en Parte I). Otra forma de marcar radiactivamente es adicionando el 32P de un dctp. Para ello se lleva a cabo la amplificación del ADN a ser utilizado como sonda adicionando el dctp-32p a la reacción Standard de PCR. -Marcado no radiactivo de sondas: En este caso la marcación se logra utilizando compuestos químicos o colorimétricos (digoxigenina o biotina), los cuales fueron adicionados a un ddntp. Este ddntp es insertado al ADN sonda usando la enzima Terminal Transferasa (ver polimerasas en Parte I). Tipos de hibridación Dot blot: Esta hibridación permite determinar la presencia o ausencia de un fragmento de ADN o ARN de interés. Tiene como ventajas que es un método rápido ya que no hace falta hacer una migración ni transferencia de ADN. Southern blot: Esta técnica consiste en hibridar sondas de ADN contra ADN total o plasmídico digerido o sin digerir. Los pasos del Southern son: extracción del ADN, digestión del ADN, migración en agarosa, 22

23 transferencia a una membrana (nitrocelulosa o nylon), hibridación y detección. A diferencia del dot blot, el Southern permite localizar tanto el gen o fragmento de interés como el contexto en el cual se encuentra y la cantidad de copias en el genoma. Hibridación de Colonia: Esta metodología tiene la ventaja de ser más rápida puesto que no involucra la extracción del ácido nucleico. Se utiliza generalmente para la determinación de la frecuencia de eventos específicos así como para realizar screenings. Hibridación in situ (FISH): Esta técnica consiste en la detección de cromosomas o porciones de ellos, con moléculas fluorescentes (marcado no radiactivo). Es útil para identificar anomalías cromosómicas y elaborar mapas génicos y genéticos. Northern blot: Esta técnica es similar al Southern blot con la diferencia que se hibridan sondas de ADN contra el ARN de un organismo, particularmente ARN mensajero. Permite evaluar la transcripción de genes, así como la cantidad de los mismos. 23