Universidad Interamericana de Puerto Rico Recinto de Brranquitas Departamento de Ciencias y Tecnología

Transcripción

1 Universidad Interamericana de Puerto Rico Recinto de Brranquitas Departamento de Ciencias y Tecnología Profesora: Sullymar Morales Marrero Biotecnología Molecular

2 Objetivos (Todos estos fueron cumplidos en el laboratorio) Definir que son los plásmidos. Diferenciar entre un plásmido y un vector. Mencionar los tipos de plásmidos naturales existentes. Mencionar mecanismos de transformación naturales y compararlos con los realizados en el laboratorio. Mencionar las partes importantes de los plásmidos sintetizados.

3 Objetivos Vectores de clonación Plásmidos (plasmidios) Conformaciones High and low copy number Narrow and broad host-range Orígenes de replicación (bacterias, células mamíferas) Genes de selección (bacterias, células mamíferas) Genes reporteros (bacterias, células eucariotas) Multiple cloning site Shuttle vector

4

5 Vectores DNA extracromosomal Autorepicable Primer vector sintetizado - Cohen y Boyer sintetizaron el primer plásmido cortando dos plásmidos naturales con la enzima EcoRI y ligando los mismos este fue llamado psc101. En el 1980 le concedieron las patentes.

6 Plásmido pbr322 Construida en 1974, fue uno de los primeros plásmidos modificados genéticamente para ser usado en técnicas de ADN recombinante. Estos principios fueron a menudo los vectores de bajo número de copias, lo que significa que se replican para producir sólo una o dos copias en cada célula. Derivado puc18 de pbr322 tiene un "alto número de copias" plásmido (> 500 copias por célula bacteriana).

7 Plasmid must have:

8

9 Plásmido puc 1982, de desarrollar nuevas series de plásmidos Identificación de ADN extraño que contiene células **Tienen tres característica importante: Alto número de copias Azul - blanco selección Polilinker

10 puc19 Restriction Map

11 puc19 Multiple Cloning Site

12

13

14 Analysis Recombinant DNA

15 Conformaciones de los vectores a)lineal b)circular abierto c) super enrollado

16 Características prácticas de los vectores de clonación del DNA Tamaño deberían ser lo suficientemente pequeños como para que se puedan separar fácilmente del DNA cromosómico de la bacteria hospedera. Sitio de clonación MCS posee secuencias de reconocimiento para varias enzimas de restricción. Este lugar se genera para que no se pierda un gen sino que el plásmido circular se vuelve lineal cuando digiere permitiendo la inserción de un fragmento de interés.

17 Características prácticas de los vectores de clonación del DNA Genes marcadores permiten la selección e identificación de las células transformadas mediante un plásmido recombinante de aquellas que no lo están. Ejemplos amp, tet, lacz.

18 Características prácticas de los vectores de clonación del DNA Origen de replicación (ori) lugar de replicación de forma separada a los cromosomas. Se conoce al número de plásmidos que hay en una célula. El número normal es pequeño (menor de 12 plásmidos). Plásmido de baja copias. Alto número de copias (cientos de miles de copias de plásmidos por células).

19 Origen de replicación Bacteriana (ori) Necesidad de garantizar su amplificación en bacterias. Muchos vector llevar un origen que se deriva del plásmido en E. coli (ColE1) Esto garantiza una alta tasa de amplificación, debido a que su replicación no depende en el cromosoma bacteriano. Vector con un origen p15a también puede replicar de forma independiente, pero su rango de copia es inferior a los ColE1.

20 Si se utilizan dos vectores Si el vector comparten un origen de replicación, es incompatibles porque una bacteria sólo puede replicar un origen. Por lo tanto, si se desean replicar dos vectores, deben tener dos orígenes de replicación diferentes.

21 Origen de replicación de vectores (levaduras) Yeast Integrating plasmids (YIp) Plásmidos de integración de levadura (YIp): Estos plásmidos carecen de un ORI y deben integrarse directamente en el cromosoma huésped mediante recombinación homóloga. Yeast Replicating plasmids (YRp): Replicación de los plásmidos de levadura (YRp): Estos vectores contienen una secuencia de replicación autónoma (ARS) derivado del cromosoma de la levadura. Como su nombre indica, estos vectores pueden replicarse independientemente del cromosoma de la levadura; Sin embargo, tienden a ser inestables y pueden perderse durante la gemación. Yeast Centromere plasmids (YCp): Plásmidos de centrómero de levadura (YCp): Estos son considerados vectores de baja copia e incorporan parte de una ARS, junto con parte de una secuencia de centrómero (CEN). Estos vectores se replican como si fueran pequeños cromosomas independientes y están por lo tanto se encuentran típicamente en una sola copia. Yeast Episomal plasmids (YEp): Plásmidos episomales de levadura Estos son más similares a los plásmidos bacterianos y son considerados de "alto copia". Un fragmento de la 2 micras (un plásmido de levadura natural) permite más de 50 copias a propagar de manera estable por célula.

22 Origen de replicación células animales Dado que no existen ORIs mamíferos "natural", los científicos han usurpado ORIs basada en virus para que ejerza una función parecida. Estos ORIs, sin embargo, requieren componentes adicionales expresadas dentro de la célula para la replicación eficaz. Las líneas celulares que expresan el virus de Epstein-Barr (EBV) El antígeno nuclear 1 (EBNA1) El antígeno de SV40 (293E o células 293T) permiten la amplificación episomal de los plásmidos que contienen el EBV o SV40 viral ORIs, respectivamente. La presencia de estos componentes virales ayuda a la replicación, pero no garantiza 100% de eficiencia de transfección.

23 Shuttle vector Construida de manera que se puede propagar en dos especies hospedadoras diferentes. Poseen dos orígenes de secuenciación para diversos hospedadores.

24 Plasmid must have: Gen reportero

25 Genes de selección: Genes de resistencia

26 Genes de selección Bacterias Mamíferos

27 Genes de selección (resistencia células animales)

28 Genes de selección levaduras

29 Características prácticas de los vectores de clonación del DNA Secuencias del promotor de RNA permite la transcripción in vivo e in vitro por la RNA polimerasa. Secuencias de cebadores estos permite la secuenciación de nucleótidos de fragmentos de DNA clonado que hayan sido insertados al plásmidos.

30 Tipos de vectores Clonación Expresión

31 Vectores Lambda Vectores bacteriófagos Cromosoma ƛ (lineal, 49pb) Fragmento se introduce en el centro del cromosoma Se empaquetan las partículas virales in vitro Se utilizan los fagos para infectar E. coli (crecimiento en capa) Contiene varios extremos con COS, pero en los extremos del cromosoma extremos cohesivos COS (recircula y se replica) Luego produce ciclo lítico

32 Síntesis de fragmento

33 Ciclo lisogénico y lítico

34 Proceso

35 Vectores cósmidos Cósmidos Contienen extremos COS, origen de replicación y genes de resistencia antibiótica, pero la mayoría de los genes virales se han eliminado. Similtud La clonación es en un sitio de restricción y luego se empaqueta Diferencias Se replica por el origen de replicación con bajos números de copias. Se forman colonias que la recombinación es seleccionada por antibióticos

36 Fósmidos Un fosmido, fagémido o fagómido es un tipo de Vector de clonación empleado en biotecnología, compuesto por un plásmido al que se le ha incorporado el origen de replicación de un fago filamentoso (fagos de ácido desoxirribonucleico (ADN) monocatenario), tales como el fago M13. La proteína de recubrimiento menor P3 permite que el fago se una a un receptor presente en la punta de los pili del hospedador E. coli.

37 M13

38 Cromosomas artificiales bacterianos (BAC) Grandes plásmidos de bajo número de copias Contienen genes que codifican al factor F (conjunto de genes que controla la replicación bacteriana) No esta muy claro como los BAC aceptan y replican los genes.

39 Vector expresión Estos permiten la síntesis de proteínas eucariotas en células procariotas porque tienen la secuencia promotora adyacente al sitio en donde se inserta el DNA. La RNA polimerasa bacteriana se une al promotor y sintetiza grades cantidades de RNA (inserto) que luego se traduce a proteínas. Luego la proteína puede ser aislada.

40 Vector de expresión Sin embargo, no siempre es posible expresar una proteína funcional. A veces no se puede doblar adecuadamente o modificaciones de arreglo post traduccional indispensables para el funcionamiento de la proteína. Se prefiere utilizar otro tipo de bacteria si se desea realizar dicho acto como Bacillus subtilis (secreción de proteínas). Puede haber reconocimiento como foráneo o la proteína sintetizada puede ser letal.

41 Vectores de expresión mamíferos En mamíferos se utiliza en muchos casos virus como el SV40 porque puede ser utilizado para transportar los vectores de expresión. Características Fuerte secuencia promotora (viral) Una señal de poliadenilación (cola al extremo 3 )

42 Cromosomas artificiales de levaduras (YAC) Pequeños plásmidos que han crecido en E. coli y han sido introducidos en levaduras. Es una versión en miniatura de un cromosoma eucariota Origen de replicación Marcadores de selección Dos Telomeros Centrómeros Sitio de restricción

43 Vector Ti Son plásmidos que se originan normalmente (200kb) aislado de la bacteria Agrobacterium tumefaciens. Forma un tumor de agalla. El ADN-T es parte de la (Ti) plásmido "inductor de tumores" que se realiza por la mayoría de las cepas de A. tumefaciens se inserta en el cromosoma. Dependiendo del plásmido Ti, la longitud de la región de ADN-T puede variar de aproximadamente 10 a 30 pares de kilobases (kb).

44 Vectores Ti

45 Qué significan las flechas dentro del mapa de los plásmidos?

46

47 Elementos específicos que debe tener vectores eucariotas Promotor eucarionte Señal de poliadenilación Secuencias Kozak y codón AUG Intrón Tags-proteínas de fusión ori de replicación eucarionte como el de SV40 (mamíferos) Marcador de selección para células eucariontes (para transfecciones estables) Segmentos de DNA para recombinación homóloga

48 Control de expresión en eucariotas

49 Tipos de promotores en eucariotas 1. Promotor constitutivo Un promotor no regulada que permite la transcripción continua de su gen asociado. 2. Promotor regulado La actividad de estos promotores es inducida por la presencia o ausencia de factores bióticos o abióticos. Los promotores inducibles son una herramienta muy poderosa en la ingeniería genética debido a la expresión de genes unidos operativamente a ellos se puede activar o desactivar en ciertas etapas del desarrollo de un organismo o en un tejido particular.

50 Promotores eucariontes Genes constitutivos y genes regulados. No todos los genes se expresan simultáneamente ni al mismo nivel. Genes constitutivos: los que se expresan al mismo nivel independientemente de las condiciones ambientales Genes regulados: aquellos que se expresan a distintos niveles (o no se expresan) dependiendo de las condiciones ambientales. Constitutivos: - SV40 - RSV (Respiratory syncytial virus) - CMV (citomegalovirus) - hef-1(promotor humano) - Ubc (promotor de un lentivirus) Inducibles o regulados: - Tet o T-Rex inducible por tetraciclina - Olac inducible por IPTG (isopropil-β-d-1-tiogalactopiranósido isómero de lactosa dispara el operon de expresión de lac) - Metalotioneína inducible por metales pesados - GAL4-E1b inducible por mifepristona (bloque el receptor)

51 Elementos de control de la expresión en eucariotas Ejemplo de un mrna producido por el plásmido Para la producción de una proteína gen de interés 5 5 leader 3 trailer 1 AUG (secuencia Kozak = CCRCCAUGG) 2 Secuencia señal de secreción 3 Tag para su purificación 4 Sitio de clivaje proteolítico 5 Señal de poliadenilación

52 Estrategia de genes reporteros Los genes reporteros son secuencias que codifican para proteínas de simple detección. Se usan para reemplazar productos génicos difíciles de medir y determinar actividad promotora. 5 3 PROMOTOR exón 1 intrón exón 2 PROMOTOR GEN REPORTERO e.g. luciferasa

53

54 Genes reporteros comunes en células eucariotas CAT (cloramfenicol acetiltransferasa) Transfiere grupos acetilos marcados 14 C o 3 H al cloramfenicol. La detección se da por cromatografía en capa delgada o extracción orgánica GAL (-galactosidasa) Hidroliza sustrato incoloro (ONPG) para dar producto amarillo que se cuantifica SEAP (secreted human placental alkaline phosphatase) Ensayo de fosfatasa alcalina bioluminiscente. Muy sensible LUC (luciferasa) Oxida a la luciferina emitiendo fotones. Los fotones se cuentan en un luminómetro o una cámara de recuento de fotones (ensayo in vivo). Hay diferentes luciferasas disponibles GFP (green fluorescent protein) Fluoresce por irradiación con UV se observa con microscopio de fluorescencia.

55 Control de expresión en bacterias OPERONES INDUCIBLES OPERONES REPRIMIBLES

56 Inducible operon: lactose RNA polymerase Digestive pathway model GLUCOSE is food of choice Don t need lactose digesting enzymes Gene is turned off TATA repressor gene1 gene2 gene3 gene4 DNA promoter operator repressor ACTIVE repressor protein Slide from Kim Foglia

57 Slide from Kim Foglia Inducible operon: lactose mrna lac lac lac lac Digestive pathway model When lactose is present, binds to lac repressor protein & triggers repressor to release DNA induces transcription RNA polymerase TATA lac repressor gene1 gene2 gene3 gene4 lac lac lac DNA promoter operator enzyme1 enzyme2 enzyme3 enzyme4 repressor repressor protein conformational change in repressor protein makes it INACTIVE! lac lac repressor lactose lactose repressor protein complex

58 Lactose operon What happens when lactose is present? Need to make lactose-digesting enzymes Lactose is allosteric regulator of repressor protein Slide from Kim Foglia

59 Operones reprimibles: Cuando un producto del metabolismo, el triptófano por ejemplo, está en cantidades suficientes la bacteria puede dejar de fabricar las enzimas que los sintetizan. En este sistema, el producto funciona como correpresor uniéndose al represor y de este modo detiene la síntesis proteica.

60 PROMOTORES

61 Tipos de Promotores Procariotas

62 Tipos de Promotores Eucariotas

63 Tipos de promotores Eucariotas

64 Vectores de DNA y aplicaciones Tipo de vector Máximo tamaño de inserción Aplicaciones Limitaciones Vectores plásmidos bacterianos (circulares) 6-12 Clonación de DNA, expresión de proteínas, subclonación, secuenciación directa del inserto Tamaño de inserción restringido, expresión limitada de proteínas, problema con el numero de copias, replicación restringida a las bacterias Vectores bacteriófagos (lineales) 25 DNA complementario (cdna), bibliotecas genómicas y bibliotecas de expresión Limitaciones al empaquetamiento del DNA por su tamaño de inserción, problema de replicación del hospedador Cósmido (circular) 35 Bibliotecas genómicas y de cdna, clonación clonación de grandes fragmentos Cromosoma artificial bacteriano (BAC, circular) Cromosoma artificial de levadura (YAC, circular) ,000 Bibliotecas genómicas y clonación de grandes fragmentos Bibliotecas genómicas y clonación de grandes fragmentos Restricciones de empaquetamiento del fago; no es ideal para la expresión de proteínas; no se puede replicar en células de mamíferos. Replicación restringida a las bacterias no se puede utilizar para la expresión de las proteínas. Debe crecer en la levadura; no se puede utilizar en bacteria. Vector Ti Varía dependiendo del tipo de vector Ti utilizado Transferencia de genes en plantas Limitado a su uso sólo en células vegetales ; numero de sitios de restricción distribuido aleatoriamente; el gran tamaño del vector dificulta su manipulación.

65 Vector Plasmid /Vectors Plasmid database Addgene a better way to share plasmids

66 Requisitos para seleccionar el vector Objetivo de la experimentación Huésped a ser utilizado insertar tamaño número de copias incompatibilidad (Incompatibilidad refiere al hecho de que los diferentes plásmidos a veces no pueden coexistir en la misma célula) marcador seleccionable sitios de clonación funciones vectoriales especializados

67 Los plásmidos son conocidos por ser capaz de pasar de una cepa bacteriana a otra. Sin embargo, los plásmidos no pueden trasladarse y replicar en todas las cepas.

68 Narrow and broad host-range Estrecha gama de acogida en huésped Narrow host range Uno de los patrones que vemos más en la naturaleza plásmido (NHR) un "especialista". Endosimbiontes como parásitos intracelulares tienden a especializarse a hosts específicos, es decir, se vuelven cada vez mejor a invadir y replicarse en ese huésped. Del mismo modo, muchos elementos genéticos parecen haberse especializado a una estrecha gama de anfitriones. Se cree que algunos plásmidos NHR han desarrollado en ciertos huésped para ser segundo cromosomas, probablemente debido a que eran muy estables en una cepa particular, aumentando con éxito su tamaño mediante la adquisición de genes del cromosoma del huésped.

69 Narrow and broad host-range Amplia gama de acogida en huésped Broad host range En contraste, un plásmido (BHR), un "generalista", se ha adaptado para transferir y replicar en muchas especies bacterianas diferentes y frecuentemente alejadas. Esta característica generalista de plásmidos BHR puede causar problemas en la sociedad humana, como la propagación de la resistencia a múltiples antibióticos entre las bacterias patógenas.

70 Comparativa Por tanto, parece que los plásmidos NHR funcionan como reservorios genéticos para un grupo estrechamente relacionado de bacterias. Mientras que los plásmidos BHR funcionan como especialmente activos los transportadores de genes a través de una amplia gama de especies. Incluso con todo el conocimiento sobre plásmidos que hemos ganado en los últimos 50 años, y la utilidad que han demostrado en el laboratorio, se sabe relativamente poco acerca de su origen.

71 References Glick, B. R. & Pasternack, J.J (2010). Molecular biotechnology: Principles and application of recombinant DNA. 4 th ed. USA: American Society for Microbiology. Lodge, J., Lund, P.A. & Minchin,S. (c2007). Gene cloning (electronic resource): principles and applications. New York ; Abingdon [England] : Taylor & Francis Group, c2007. Retrieved from y&v=1&bookid= Reece, R.J. (2004). Analysis of Genes and Genomes. España; John Wiley & Sons