Las bacterias poseen todos los componentes requeridos para reproducirse, cosechar y utilizar la energía del ambiente.

Transcripción

1 GENETICA BACTERIANA Griffiths A., Wessler S., Lewontin R., Gelbart W., Suzuki D., Miller J. (2005) Introduction to Genetic Analysis (8 th ed). W.H. Freeman and Company, New York. QH430/I59/2005

2 Las bacterias poseen todos los componentes requeridos para reproducirse, cosechar y utilizar la energía del ambiente. Se reproducen rápidamente, una célula da origen a dos idénticas en cada ciclo de división, produciendo un colonia de individuos idénticos.

3 Suspensión celular bacteriana Suspensión plaqueada en caja con agar Incubación 1 2 días Caja Petri con agar Células individuales invisibles a simple vista Colonias visibles procedentes de una célula individual (mismo genotipo y fenotipo)

4 Mutantes bacterianas Prototróficas : Son bacterias silvestres que pueden crecer en medios mínimos (sales inorgánicas, fuente de carbono glucosa y agua). A partir de estas sustancias mínimas las bacterias pueden construir todas las macromoléculas necesarias para vivir. Auxotróficas : Las bacterias son generalmente mutantes y no pueden crecer a menos que se adicionen al medio nutrientes específicos (Adenina, biotina, metionina, etc.) Resistencia o susceptibilidad a antibióticos Marcadores Genéticos

5 Requiere biotina como suplemento Requiere arginina como suplemento Requiere metionina como suplemento No puede utilizar lactosa como fuente de carbono No puede utilizar galactosa como fuente de carbono Resistente al antibiótico estreptomicina Susceptible al antibiótico estreptomicina Medio mínimo: medio sintetico básico para el crecimiento bacteriano sin nutrientes adicionales

6 Transferencia genética horizontal Transferencia genética vertical

7 Mecanismos de Transferencia Genética Horizontal

8 La bacteria donadora es la que contribuye con una fracción de material genético a la bacteria receptora El fragmento de DNA donado es llamado exogenota y el genoma receptor el endogenota Una bacteria que contiene ambos DNAs, el exogenota y el endogenota es merocigoto a + b + Exogenota a b Endogenota

9 DNA bacteriano DNA plasmídico DNA viral Material Genético Transferido

10 Conjugación bacteriana E. coli William Hayes, 1953 F + (Factor de fertilidad) Pili F - F + Plásmido F *Plásmido F codifica alrededor de 100 genes

11 GENOTIPO FENOTIPO

12 Es el plásmido F el responsable de fenotipo WT después de la Conjugación?

13 F + F La frecuencia de transferencia de F es mayor a la frecuencia de recombinantes para los marcadores genéticos que se estudiaron!

14 Estos marcadores genéticos residen en el DNA del cromosoma bacteriano

15 Para la transferencia de DNA del cromosoma bacteriano mediante conjugación, se necesita la INSERCIÓN del plásmido F al cromosoma generando una célula Hfr

16 High Frequency of Recombination Integración de F al cromosoma bacteriano El bajo nivel de transferencia de marcadores genéticos se debe a la presencia de unas pocas celulas Hfr en la población F+

17 La inserción de plásmido F en el cromosoma bacteriano puede ocurrir en diferentes lugares mediante recombinación (sitios IS y Tn1000 )

18 Integración del plásmido F al cromosoma O Orientación del origen O O Dependiendo de la orientación del Origen de replicación de F durante la integración, comenzarán a transferirse los marcadores genéticos

19 Experimentos de conjugación interrumpida Wollman y Jacob, 1957 azi s ton s lac gal azi r ton r lac + gal + F - str r Hfr str s Str +

20 Después de 2 h algunos exconjugantes se convierten en Hfr F d c b a O

21 Orden de Transferencia de Marcadores Genéticos

22 Dos eventos de recombinación Generalmente la Conjugación se interrumpe antes de que se transfiera todo el Hfr; el exogenota es lineal y el endogenota es circular. Ocurren dos eventos de recombinación.

23 Recombinación entre exogenote y endogenote No viable Doble entrecruzamiento! a + a No viable a a + + Viable Recombinantes recíprocos Merocigoto

24 Conclusiones: 1. El cromosoma de E. coli es circular. 2. El plasmido F es circular. 3. La orientación en la que se intergra F al cromosoma determina la polaridad del cromosma Hfr. 4. Un extremo de F integrado es el Origen donde comienza la transferencia y el otro extremo es el término que NO se transfiere a menos que antes se haya transferido TODO el cromosoma Hfr.

25 Resumen de la Conjugación bacteriana

26 PLÁSMIDOS Elementos de ADN extracromosomal, de doble cadena circular, covalentemente cerrado. Contienen: origen propio de replicación, sitios de reconocimiento para enzimas de restricción, marcadores de selección (resistencia a antibióticos). Presentes en elevado número de copias en la célula. 1. Eco RI 2. Sa/I 3. tetracycline resistance 4. origin of replication 5. Pstl 6. amplicillin resistance 7. Pst I 8. EcoRI 9. SalI

27 CLASIFICACIÓN DE PLÁSMIDOS Por su capacidad de transferencia: -Conjugativos (a través de un pili a otra membrana) -No conjugativos Por sus efectos fenotípicos: -Fertilidad (factores F) -Plásmidos bacteriocinogénicos (codifican una proteína tóxica para otras bacterias que no portan ese tipo de plásmido) -Plásmidos de resistencia (factores R) Por el número de copias: -Relajados (>1000 copias/célula) -Restringidos (<100 copias/célula)

28 Episoma (F ) : Plasmido F con genes bacterianos

29 Exconjugante Donadora

30 Mapeo por frecuencia de recombinantes Si seleccionamos leu como marcador: Podemos medir la distancia entre los genes porque todos tienen la misma oportunidad de incorporarse al cromosoma receptor La frecuencia de recombinación indicará la distancia entre los genes

31 Las posibilidades de recombinación que existen: 4% 9% 87% muy poco frecuente 0%

32 leu + arg - met - 4% leu + arg + met - 9% leu + arg + met + 87% leu -- arg 4 u.m. y arg met 9 u.m.

33 En E. coli, cuatro cepas Hfr donaron los siguientes marcadores genéticos en el orden: Cepa 1: Q W D M T Cepa 2: A X P T M Cepa 3: B N C A X Cepa 4: B Q W D M Todas las cepas Hfr strains derivan de la misma cepa F+. Cuál es el orden de los marcadores en el cromosoma original? (2) (4) C N A (3) B X (1) Q P W T D M

34 Tarea: 1) Se realizó la conjugación entre una cepa Hfr que es met+ thi+ pur+ con una cepa F que es met thi pur de manera interrumpida. Se encontró que met es el marcador que se transfiere último, así que los exconjugantes se seleccionaron en un medio sin metionina. Para probar la presencia de los alelos thi+ y pur+ se hizo selección en medios sin estos compuestos, encontrando los siguientes datos: met+ thi+ pur+ 280 met+ thi+ pur- 0 met+ thi pur+ 6 met+ thi- pur- 52 Determina el orden de estos marcadores en el cromosoma Calcula la distancia entre los marcadores en unidades de mapa

35 2) Se aisló una bacteria mutante con fenotipo StrR pero incapaz de usar acetato como fuente de carbono (ace-). Para determinar dónde mapea el gen responsable de la mutación se utilizó la conjugación con cuatro cepas diferentes donadoras StrS ace+ Hfr que se muestran. Las flechas indican la posición y orientación de F en cada Hfr. a) En qué medio seleccionamos los exconjugantes en este experimenmto? b) Cómo vamos a excluir las células donadoras en este experimento? c) Si se tienen los siguientes resultados, ubica el gen ace en el mapa (tomando en cuenta el tiempo en minutos).