Producción de una proteína verde fluorescente (GFP). ETAPA 1: CRECIMIENTO CELULAR E INDUCCIÓN COSECHA ETAPA 2: MICROFILTRACION

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1 Producción de una proteína verde fluorescente (GFP). ETAPA 1: CRECIMIENTO CELULAR E INDUCCIÓN COSECHA ETAPA 2: MICROFILTRACION ETAPA 3: DISRUPCIÓN CELULAR CENTRIFUGACION SOBRENADANTE PRECIPITADO (PELLET) FILTRACION ETAPA 4: PURIFICACIÓN 1

2 ETAPA 1: CRECIMIENTO CELULAR E INDUCCIÓN PROTOCOLO Protocolo para Ensayo de Crecimiento Celular e Inducción Lote: Objetivo: Obtención de biomasa para la producción de la proteína GFP 1. Microorganismo: E. coli 2. Medios Medio LB glucosa Ampi+ Kana+: 500 ml para erlenmeyers. Medio LB glucosa Ampi+ Kana+: 3000 ml para erlenmeyers. 3. Soluciones de alimentación Acido Sulfúrico 1 % V/V Antiespumante 1,5 % Hidroxido de sodio 5% Glucosa 50% Volumen: Volumen: Volumen: Volumen: 4. INÓCULO: 4.1. PREPARACION A partir de un WCB se realiza un cultivo en caldo LB conteniendo Ampicilina (100 ug/ml) y Kanamicina (25 ug/ml) Se siembran 100 ul en c/u de los tres erlenmeyer CONDICIONES DE OPERACIÓN Hora y fecha de inicio:. /.. Temperatura: 37 ºC 2

3 Agitación: 250 rpm Hs de cultivo: Equipo: 4.3. Muestras y Control Muestrear cada uno de los inóculos Tomar 1 ml de c/ u. para realizar O.D a 600 nm y observar al microscopio. Realizar un Pool. Tomar dos Muestras del Pool B- Muestra para: O.D 600 nm, masa seca ph. 5. FERMENTACIÓN 5.1. Fase de Crecimiento Volumen final: 3,0 l Volumen de fermentación 1 : Condiciones de cultivo en B5: ph: 7 Temperatura: 37ºC Agitación: 300 rpm Saturación de O 2 : 50% (control cascada: agitación y sparger) Muestreo: O.D (por hora) Masa Seca (por hora) UFC con y sin antibiótico (esteril) Glucosa (cada 30 min) para Mo y Mf (Preinducción) 5.2. Fase de Inducción Acondicionamiento del cultivo: Previo a la inducción del cultivo, realizar agregado de:.. 1 Sujeto al inóculo, se puede retirar el excedente de medio. 3

4 5.3. Inducción: Agregado del Inductor: 3 ml de IPTG Condiciones de cultivo inducido: ph: 7 Temperatura: 37ºC Agitación: 300 rpm Saturación de O 2 : 50% Muestreo: O.D (por hora) Masa Seca (por hora) UFC con y sin antibiótico (esteril) Glucosa (cada 30 min) SDS-PAGE I0, I1 e I2 para If 4

5 Técnicas analíticas empleadas en la Etapa 1 Crecimiento Celular e Inducción Cuantificación estimada de Glucosa 1. Alicuotar 0,5-1 ml de muestra de cultivo en un tubo plástico. 2. Centrifugar a 30 segundos a velocidad máxima. 3. Preparar una solucione estándar de 1 g/l de glucosa. 4. Alicuotar dos tubos con 1 ml de reactivo enzimático provisto en el kit. Mantener estos tubos y el reactivo en hielo. 5. Agregar 10 µl de muestra o solución estándar, según corresponda, por cada tubo de reacción. Vortexear 2 6. Llevar a incubar 1 min a temperatura ambiente. 7. Comparar intensidad de color e informar mayor, igual o menor a 1 g/l. 1 La reacción comienza en el momento que la muestra se mezcla con el reactivo. Para procurar que la reacción comience en todos los tubos al mismo tiempo se aconseja depositar los 10 µl de muestra en la pared del tubo. Una vez que todos los tubos tengan la muestra, vortexear para mezclar. Recuento de UFC en placa Objetivo: Describir el protocolo a seguir en el recuento Microbiológico de las distintas muestras de cultivos celulares. Fundamento del método: Existen distintos modos de seguir el crecimiento celular de un cultivo bacteriano o de levaduras, uno de los métodos más tradicionales es el recuento microbiológico, el cual consiste en hacer crecer las muestra en un medio de cultivo semi-sólido y contar el número de colonias detectadas, diluyendo la muestra de tal forma de contar entre 30 y 300 colonias sobre la placa. Cabe destacar que el resultado obtenido en cada conteo depende del medio en el que se realiza el plaqueo; esto implica dos consideraciones a tener en cuenta: 1) Representa una limitación para el recuento de microorganismos, pues no todos pueden crecer en medios elaborados; incluso, para algunos microorganismos no se han podido diseñar aún, medios de crecimiento aceptables. 2) El número real de microorganismos no es exacto, pues el fundamento de método indica que el recuento de microorganismos dará como resultado el número de colonias que puedan crecer en el medio de cultivo semisólido utilizado. No obstante, se pueden tomar los resultados como referencia. 5

6 Si las muestras poseen una dilución adecuada, los microorganismos crecerán como colonias aisladas sobre el medio de cultivo-semisólido, dado que el mismo evita la dispersión de las bacterias/levaduras. Los puntos detectados como resultado del plaqueo microbiológico indicarán clones independientes de una célula progenitora. Procedimiento: Encender la campana según POE CC Operatoria de trabajo en Cabina de Seguridad Telstar Bio II A y Flujo Laminar Horizontal Telstar AH-100. Realizar diluciones en la muestra de modo tal de sembrar 100 ul que contengan entre 30 y 300 colonias. Ref. 1 OD: 7X10 8 bacterias. Una vez realizados los cálculos, diluir las muestras bajo cabina con solución fisiológica estéril y proceder a sembrar las placas por duplicados, dos diluciones distintas (4 placas por muestra). Se sembrará en cada placa 100 ul de la dilución preparada; luego se dispersará el volumen agregado con la espátula de Drigasky o rastrillo de vidrio (estéril). Incubar las placas a 37 C toda la noche o a temper atura ambiente por 2 días. Calcular UFC/Ml empleando la siguiente fórmula: UFC/ML = N Col. * Factor de dilución Volumen Sembrado en ml Nota: N Col.: Número de colonias detectadas al fina l de la incubación. 6

7 ETAPA 3 DISRUPCIÓN CELULAR. PROTOCOLO RUPTURA CELULAR PROYECTO Fecha: LOTE: 1. Proceso de Ruptura: Se necesitan dos operadores para realizar el proceso Homogenizar la muestra por 5 minutos en frío con agitador magnético Tomar muestra Pre - Ruptura de la solución resuspendida en buffer de Lisis Realizar la ruptura a 800 bares manteniendo en lo posible la temperatura por debajo de los 10 ºC. Muestrear (10 ml) luego de cada ciclo de ruptura para los sig. ensayos: Observar al microscopio. Evaluar los valores de absorbancia 600 nm. Evaluar los valores de absorbancia a 260/280 nm Evaluar Concentración de proteínas en la fracción sobrenadante Preparar muestra para SDS-PAGE Completar la tabla 1 mientras se realizan los ciclos de ruptura Ciclo Nº1 Nº2 Nº3 Nº4 Nº5 Hora inicio Temp º C Inicio ciclo Control Flujo Temp º C Fin ciclo IN OUT IN OUT Hora fin proceso Flujo X ml/ min Toma de muestra. Tabla 1.Registro de Operaciones Introducir los frascos de las muestras en hielo a medida que se toman y entregar a Control de Calidad. Rotular y conservar el extracto crudo a 4ºC mientras se continúa con el posterior proceso. Nota: Recordar conservar muestra del buffer de ruptura para su utilización como blanco de las mediciones de absorbancia y concentración de proteínas. 7

8 Procedimiento: Semi-Cuantificación de Proteínas por el método de Bradford 1. A partir de la solución de BSA 1mg/mL, hacer una dilución 1:10 (concentración final = 100µg/mL), se recomienda preparar por lo menos 1,5 ml de patrón 1:10 de albumina. 2. Preparar las diluciones que se muestran en la tabla 1, sobre la microplaca de 96 pocillos para conformar la curva patrón, cada punto de la misma debe prepararse por triplicado. Muestra (µl) N/A Puntos Bco S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 Conc. final de BSA (µg/ml) H 2 O (µl) BSA working sl. (µl) Muestra Reactivo bradford (c) 40 µl Tiempo de Trascurridos los 5 minutos de reacción observar escala de reacción intensidades Tabla1: Muestra el protocolo a seguir para realizar el ensayo. 3. Preparar las muestras en tubos eppendorf sembrando un volumen final de 160 µl y agregar con la micropipeta multicanal en cada pocillo de la placa 40 µl de reactivo de Bradford comercial concentrado. Nota: agregar el reactivo a las muestras y las diluciones patrón al mismo tiempo. 4. Mezclar los pocillos con la micropipeta multicanal muy suavemente. 5. Incubar las muestras y los patrones 5 minutos a temperatura ambiente 6. Estimar el orden de las concentraciones de cada muestra. 7. Informar al área de Control de Calidad. 8

9 Cuantificación de Proteínas por el método de Bradford Objetivo: La técnica detallada a continuación tiene como finalidad la cuantificación de proteínas totales. Originalmente descripta por Bradford se ha convertido en el método preferido para la cuantificación de proteínas en muchos laboratorios. Ésta es una técnica más simple, rápida y más sensible que el método de Lowry. Fundamento del método: El método de Bradford se basa en la unión del colorante Coomassie Blue G250 a las proteínas. Estudios detallados indican que el colorante libre puede existir en cuatro formas iónicas diferentes para las cuales los valores de pka son 1,15, 1,82 y 12,4. De las tres formas cargadas del colorante que predominan en la solución acidificada del ensayo, las formas catiónicas roja y verde tienen absorbancia máxima a 470nm y 650nm respectivamente. En contraste, la forma más aniónica del colorante, la cual se une a las proteínas, tienen una absorbancia máxima a 590nm. Así la cantidad de proteína puede ser estimada si se determina la cantidad de colorante en la forma iónica azul. Esto se logra usualmente midiendo la absorbancia de la solución a 595nm. Procedimiento: A partir de la solución de BSA 1mg/mL, hacer una dilución 1:50 (concentración final = 20µg/mL), se recomienda preparar por lo menos 1,5 ml de patrón 1:50 de albúmina. Realizar las diluciones indicadas en la tabla y homogeneizar con vortex, los puntos de la curva o muestras deberán realizarse por triplicado. Por último agregar 200 ul de reactivo de Bradford, según lo indica la tabla 1, mezclar con agitador, aguardar 5 minutos y realizar la lectura a 595 nm. Realizar los cálculos de regresión para obtener la curva de calibración. Calcular la concentración de muestra de acuerdo a la curva obtenida 3 3 Recordar agregar entre las muestras, el correspondiente al blanco de cuantificación (buffers en que se encuentra la muestra) y recordar restar al valor obtenido para este blanco a las muestras correspondientes. 9

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11 Cuantificación de glucosa Objetivo: Determinar la concentración de glucosa en una muestra de medio de cultivo mediante el kit de glicemia enzimática AA de Wiener Lab. Fundamento del método: La técnica se basa en las siguientes reacciones enzimáticas que producen un compuesto coloreado. GOD Glucosa + O 2 + H 2 O Ácido glucónico + H 2 O 2 POD H 2 O AF + 4-hidroxibenzoato quiminona roja Las enzimas provistas en el kit son la glucosa oxidasa (GOD) y la peroxidada (POD). Además el reactivo contiene el 4-aminofenazona (4-AF) y el 4-hidroxibenzoato. Procedimiento: 8. Alicuotar 0,5-1 ml de muestra de cultivo en un tubo plástico. 9. Centrifugar a 3 minutos a velocidad máxima. 10. Preparar una dilución del sobrenadante obtenido en 2. de modo tal que entre dentro del rango de calibración de la técnica (Hasta 0,75 g/l). 11. Preparar las soluciones estándar (0, 75 g/l, 0,5 g/l, 0,25 g/l y 0,125 g/l) a partir de diluciones de la solución 1 g/l de glucosa. 12. Por cada reacción alicuotar 1 ml de reactivo enzimático provisto en el kit en un tubo de 1,5 ml. Mantener estos tubos y el reactivo en hielo. 13. Agregar 10 µl de muestra o solución estándar, según corresponda, por cada tubo de reacción. Agregar 10 µl de agua para hacer el blanco del ensayo. Vortexear 4. Los puntos de la curva o muestras analizadas deberán realizarse por duplicado. 14. Llevar a incubar en la estufa por 5 minutos a 37 C. 15. Medir la absorbancia a 490 nm en la lectora de placas. 16. Realizar los cálculos de regresión para obtener la curva de calibración. 17. Calcular la concentración de muestra de acuerdo a la curva obtenida 5 4 La reacción comienza en el momento que la muestra se mezcla con el reactivo. Para procurar que la reacción comience en todos los tubos al mismo tiempo se aconseja depositar los 10 μl de muestra en la pared del tubo. Una vez que todos los tubos tengan la muestra, vortexear para mezclar. 5 Recordar agregar entre las muestras, el correspondiente al blanco de cuantificación (buffers en que se encuentra la muestra) y recordar restar al valor obtenido para este blanco a las muestras correspondientes. 11

12 ANEXO: Técnicas analíticas empleadas en Control de Calidad en todas las etapas. Composición de geles de Poliacrilamida Gelal 16% 1 gel 2 geles 4 geles Agua destilada 0,95 ml 1,9 ml 3,8 ml Tris-HCl 1,5M ph8,8 1,25 ml 2,5 ml 5 ml SDS 10% 50 µl 100 µl 200 µl APS 10% 50 µl 100 µl 200 µl TEMED 3,5 µl 7,0 µl 14,0 µl Acrilamida 30% 2,7 ml 5,4 ml 10,8 ml Volumen final 5 ml 10 ml 20 ml Gel concentrador 1 gel 2 geles 4 geles Agua destilada 0,95 ml 1,9 ml 3,8 ml Tris-HCl 0,5M ph 6,8 375 µl 750 µl 1,5 ml SDS 10% 15 µl 30 µl 60 µl APS 10% 17,5 µl 35 µl 70 µl TEMED 3,5 µl 7,0 µl 14,0 µl Acrilamida 30% 200 µl 400 µl 800 ml Preparación de muestras: Las muestras se prepararán agregando buffer muestra (BM) de manera de obtener mezclas de siembra con las siguientes características: - Geles de Inducción: o Resuspender el equivalente a 1 OD en 200 ul de BM y hervir por 5 min. o Sembrar 15 ul por calle - Geles de ruptura: o Centrifugar 200 ul de muestra o Basado en el cálculo de proteínas totales, resuspender la muestra de sobrenadante de manera de sembrar en el gel 4,5 ug de 12

13 proteína total y el pellet en las mismas condiciones del sobrenadante. o Hervir por 5 min y sembrar 15 ul por calle. - Geles de purificación: o Basado en el cálculo de proteínas totales, resuspender la muestra de manera de sembrar en el gel 4,5 ug de proteína total (Coomassie Coloidal) o 0,4 ug de proteína total (Plata). o Hervir por 5 min y sembrar 15 ul por calle. - Tinción con Coomassie Coloidal 1. Coloración: Solución de Coomassie Coloidal, toda la noche. 2. Verificar una coloración fuerte, en caso negativo 3. Lavar con agua destilada ( 2 lavados de 3 minutos) 4. Coloración: Solución de Coomassie Coloidal: Durante 1 hora. - Tinción con Plata Objetivo: El siguiente protocolo tiene como objetivo describir el método de tinción con plata sobre un gel de Poliacrilamida. Dicho método es capaz de detectar pequeñas cantidades de proteínas dentro de una banda, luego de haber realizado una corrida electroforética. El mismo presenta una alternativa de tinción interesante y mas resolutiva que la tinción con colorante Coomassie blue. Fundamento del método: El procedimiento de tinción con plata se basa en la reducción de Ag + a Ag 0. Se ha propuesto que el catión de plata forma un complejo con los grupos amino de las proteínas particularmente con los grupos ε-amino de lisina y los grupos sulfuros de cisteína y metionina. Por otra parte se ha demostrado que el grado de tinción no puede ser atribuido a aminoácidos específicos proponiéndose como responsables de la tinción diferencial a elementos en la estructura proteica más grandes que aminoácidos, los polipéptidos. El AgNO 3 levemente acidificado (ph 6), se utiliza para impregnar el gel en este momento la plata metálica se acompleja con las proteínas, posteriormente se realiza un revelado que tiende a reducir el complejo con formaldehído en medio alcalino (en este caso se utiliza carbonato de sodio). Procedimiento: 1. Fijación: Solución de 50% metanol + 5% ácido acético por 20 minutos. 2. Lavado 1: Solución de metanol 50% en agua por 10 minutos. 3. Lavado 2: Agua destilada por 10 minutos. 13

14 4. Sensibilización: Solución de tiosulfato de sodio 0,02% por un minuto 5. Lavado 3: Lavar dos veces con agua por un minuto 6. Tinción: Solución fría de AgNO 3 0,1% por 20 minutos. Preservar de la luz tapando el recipiente plástico únicamente con su tapa. No usar papel de aluminio. 7. Lavado 4: Lavar dos veces con agua destilada por 1 minuto (este es un paso critico si lavan de mas la plata solubiliza fácilmente en agua y la tinción no resulta). 8. Revelado: Solución de Na 2 CO 3 2% + 0,04% formaldehído con agitación. Después de segundos reemplazar la solución de revelado. Se puede cambiar de nuevo a los 2-3 minutos. Dejar que se revele hasta el grado deseado. 9. Detención: Ácido acético 5% 2 veces por 3 minutos. 10. Conservación: Ácido acético 1 % a 4 C. Observaciones: Evitar en todo momento tocar el gel con las manos o los guantes. Manipular con espátulas perfectamente limpias. Las soluciones de tiosulfato de sodio, nitrato de plata y carbonato de sodio deben ser frescas. Preparar antes de usar. Se aconseja dejar el gel en solución de fijación por 1h. El paso de fijación también puede ser toda la noche. Una vez que se obtuvo el gel teñido, se recomienda registrar en breve (mediante escaneo o fotografía), ya que se va perdiendo nitidez con el tiempo. Se sugiere secar el gel para su conservación permanente. 14