Separación de lipidos individuales y lípidos neutros

Transcripción

1 Trabajo Práctico N o 4 Separación de lipidos individuales y lípidos neutros Ramiro Olivera (ramaolivera@hotmail.com) Fabián Shalóm (fabianshalom@hotmail.com) Junio de 2005 Cátedra de Química Biológica - Escuela de Ciencia y Tecnología Universidad Nacional de San Martín Introducción Los lípidos pueden clasificarse en lípidos neutros, como acilgliceroles y ésteres de colesterol, y lípidos anfipáticos, los cuales están compuestos por una porción polar y otra no polar, como fosfolípidos y colesterol libre. Dada su estructura molecular, son sustancias poco solubles en solventes polares, lo que permite aislarlos de los tejidos fácilmente utilizando solventes orgánicos. Para separar los lípidos de una muestra se utilizan habitualmente técnicas cromatográficas, como la TLC o cromatografía en capa delgada. La misma puede realizarse en forma monodimensional o bidimensional, dependiendo de la naturaleza del compuesto a separar. Para separar fosfolípidos individuales se utiliza la cromatografía bidimensional en placas de sílica gel 60 en soporte de vidrio, utilizando como solvente de corrida una mezcla de solventes orgánicos alcalinos en la primer dimensión y una mezcla a ph ácido en la segunda, distinguiéndose bandas correspondientes a fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol, fosfatidilserina, ácido fosfatídico, etc. La cromatografía monodimensional en palca de sílica gel 60 se utiliza en cambio para la separación de acilgliceroles, pudiéndose identificar bandas correspondientes a monoacilglicerol, 1,2 diacilglicerol, 1,3 diacilglicerol y triacilglicerol. Para la identificación de los compuestos en ambas técnicas se utilizan patrones conocidos y se revelan mediante la exposición de las placas a vapores de iodo (I 2 ), los cuales colorean las distintas bandas permitiendo su visualización. Objetivo El objetivo de este trabajo es separar lípidos neutros y fosfolípidos individuales contenidos en una muestra, mediante cromatografía en capa delgada monodimensional y bidimensional. Luego de la corrida se debe identificar y clasi- 1

2 ficar los correspondientes lípidos por medio de la comparación con un patrón de corrida conocido. Desarrollo A fin de visualizar y caracterizar los lipidos presentes en una muestra desconocida se utilizó la técnica de cromatografía de capa delgada (Thin layer chromatography - TLC ) monodimensional y bidimensional; para lípidos neutros y fosfolípidos respectivamente. En el caso de la separación de lípidos neutros se realizó la siembra de dos muestras distintas en forma de banda en la correspondiente placa de sílica gel. Las muestras diferían en el contenido de indigotina. El mismo es un colorante de uso comercial cuyo objetivo era aumentar el contraste para lograr la visualización de las bandas. Esta corrida se realizó en forma unidimensional utilizando como solvente de elución ácido acético:hexano:dietileter 2.5:60:40. Luego de dos horas de corrida se reveló la placa, lográndo identificarse los correspondientes lípidos. Para la caracterización de fosfolípidos se realizó una corrida bidimensional. En la misma se siembró la muestra en forma de punto, en el extremo inferior izquierdo de la placa de sílica gel. Se utilizó como solvente de elución una solución formada por cloroformo:metanol:hidróxido de amonio 65:25:5. Luego de dos horas de corrida, se secó la placa, se la rotó noventa grados y se cambió la fase movil. Este segundo solvente constaba de cloroformo:acetona:etanol:ácido acético:agua 3:4:1:1:0.5. Se dejó la placa corriendo durante una hora y cuarenta minutos, tras lo cual se reveló con vapor de iodo. El trabajo de laboratorio concluyó con la comparación de ambas placas con un patrón de corrida estándar proporcionado por la Cátedra. Resultados Luego de realizadas ambas corridas en placas de silica gel se comparó el patrón de distribución de los lípidos con un patrón estándar conocido. De esta manera se pudo separar y clasificar los lípidos presentes en la muestra. En la figura 1se puede observar una fotografía de la corrida unidimensional que se utilizó para determinar los lípidos neutros. En la misma se puede observar los posibles lípidos presentes en la muestra. En la figura 2 hay una fotografía de placa de silica gel utilizada en la corrida bidimensional. En esta pueden observarse los siguientes fosfolípidos: lisofosfatidilcolina (LPC ), esfingomielina (SPH ), fosfatidilcolina (PC ), lisofosftatidiletanolamina (LPE), fosfatidilinositol (PI ), fostatidiletanolamina (PE), cardiolipina (CL) y ácido fosfatídico (PA). 2

3 Conclusiones A partir de las dos corridas en sílica gel se logró separar los lípidos constituyentes de la muestra incógnita. Los lípidos neutros fueron separados por cromatografía de capa delgada (TLC ) monodimensional mientras que para los fosfolípidos se empleó TLC bidimensional. Utilizando las mismas técnicas, que en este trabajo, se podría haber corrido una muestra patrón conocida a fin de determinar los lipidos neutros o fosfolípidos conocidos. De esta manera se lograría clasificar los lípidos presentes en la muestra incógnita por comparación. Las técnicas que se aplicaron en este trabajo no pueden ser utilizadas para determinar la concentración de las sustancias presentes. Para este fin pueden utilizarse técnicas colorimétricas. Referencias [1] Nelson D.L. y Cox M.M. (2004) Principles of Biochemistry - 3ra Edición [2] Alonso Blanco A. (1995) Química Biológica - 6ta Edición - Ed. El Ateneo. 3

4 Figura 1: Fotografía de la placa de silica gel luego de la corrida unidimensional. Nota: Esta imagen fue modificada digitalmente a fin de mejorar el contraste. 4

5 Figura 2: Fotografía de la placa de silica gel luego de la corrida bidimensional. Nota: Esta imagen fue modificada digitalmente a fin de mejorar el contraste. 5