PURIFICACIÓN DE ENZIMAS

Transcripción

1 PURIFICACIÓN DE ENZIMAS MÉTODOS GENERALES DE EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN CAMILO BECERRA (TUQ) MARÍA FERNANDA FERRERO (TUQ)

2 INTRODUCCIÓN EN LA NATURALEZA EXISTEN CANTIDADES INIMAGINABLES DE COMPUESTOS, PERO EN ESPECIAL EXISTEN UNAS PEQUEÑAS MACROMOLÉCULAS QUE SON DE MUCHO INTERÉS EN EL MUNDO CIENTÍFICO LAS PROTEÍNAS EN DONDE DÍA A DÍA SE DESARROLLAN NUEVAS TÉCNICAS DE EXTRACCIÓN, PURIFICACIÓN E INVESTIGACIONES EN LA CODIFICACIÓN DE LAS MISMAS, DENTRO DE ESTE GRAN UNIVERSO DE LAS PROTEÍNAS HAY UNAS MUY ESPECIALES QUE TRABAJAREMOS CON MÁS DETALLE EN ESTA MONOGRAFÍA, QUE SON LAS ENZIMAS. LOS PROCESOS CATALIZADOS POR ENZIMAS EN LA INDUSTRIA SON NUMEROSOS, YA QUE PRESENTAN UNA SERIE DE VENTAJAS FRENTE A LOS CATALIZADORES CONVENCIONALES NO BIOLÓGICOS.

3 OBJETIVOS EN ESTA MONOGRAFÍA SIMPLEMENTE DAREMOS EN ASPECTOS GENERALES LOS PRINCIPALES MÉTODOS DE PURIFICACIÓN. APRENDER LA EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ENZIMAS MEDIANTE DISTINTOS MÉTODOS.

4 QUÉ ES UNA ENZIMA Y CUÁL ES SU FUNCIÓN? UNA ENZIMA ES UNA PROTEÍNA GLOBULAR QUE NO TIENE FUNCIÓN MECÁNICA NI ESTRUCTURAL, PERO QUE ACTÚA COMO BIOCATALIZADORES PARA MANTENER EL PROCESO METABÓLICO Y CON ELLO, LAS FUNCIONES VITALES. SE COMBINA CON UNO O MÁS COMPUESTOS DE FORMA QUE REACCIONAN A MAYOR VELOCIDAD A LA QUE LO HARÍAN SIN ENZIMA.

5 CONCEPTOS BÁSICOS ACTIVIDAD ESPECIFICA LA ACTIVIDAD ESPECÍFICA ES EL NÚMERO DE UNIDADES ENZIMÁTICAS POR MILIGRAMO DE PROTEÍNA. LA ACTIVIDAD ESPECÍFICA CONSTITUYE UNA MEDIDA DE LA PUREZA ENZIMÁTICA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA SE DEFINE COMO LA CANTIDAD DE ENZIMA QUE PRODUCE LA TRANSFORMACIÓN DE UN MICROMOL DE SUSTRATO POR MINUTO A 25ºC

6 CONCEPTOS CLAVES EXTRACCION: PARA EXTRAER ENZIMAS HAY QUE TRITURAR O MOLER LA FUENTE DE DONDE SE DESEA OBTENER LOS ENZIMAS, YA SEA, DE ORIGEN VEGETAL O ANIMAL. LUEGO SE DEBE HOMOGENEIZAR CON ALGÚN DISOLVENTE O UNA SOLUCIÓN BUFFER. PURIFICACIÓN: EN EL CASO DE PROTEÍNAS ENZIMÁTICAS, SE PUEDE DETERMINAR LA CANTIDAD DE ENZIMA EN UNA DISOLUCIÓN O EXTRACTO DE TEJIDO DETERMINADO EN FUNCIÓN DEL EFECTO CATALÍTICO QUE PRODUCE LA ENZIMA.

7 MÉTODOS DE PURIFICACIÓN DE ENZIMAS PURIFICACIÓN POR PRECIPITACIÓN EN LA PRECIPITACIÓN SE CONCENTRA EL SOLUTO DE UNA SOLUCIÓN CONVIRTIÉNDOLO EN SÓLIDO MEDIANTE LA ACCIÓN DE UN AGENTE PRECIPITANTE. PURIFICACIÓN POR DIÁLISIS ES UN PROCEDIMIENTO QUE SEPARA LAS PROTEÍNAS DE LOS DISOLVENTES APROVECHANDO EL MAYOR TAMAÑO DE LAS PROTEÍNAS. LA DIÁLISIS RETIENE LAS PROTEÍNAS GRANDES COMO POR EJEMPLO ENZIMAS DENTRO DE LAS MEMBRANAS.

8 MÉTODOS DE PURIFICACIÓN DE ENZIMAS ELECTROFORESIS LA ELECTROFORESIS ES LA MIGRACIÓN DE SOLUTOS IÓNICOS BAJO LA INFLUENCIA DE UN CAMPO ELÉCTRICO; ESTAS PARTÍCULAS MIGRAN HACIA EL CÁTODO O ÁNODO (ELECTRODOS - Y +), EN DEPENDENCIA DE UNA COMBINACIÓN DE SU CARGA, PESO MOLECULAR Y ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL. TIPOS DE ELECTROFORESIS: ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA CON DODECILSULFATO DE SODIO (PAGE- SDS)

9 MÉTODOS DE PURIFICACIÓN DE ENZIMAS CROMATOGRAFÍA LA CROMATOGRAFÍA ES ESENCIALMENTE UN MÉTODO FÍSICO DE SEPARACIÓN EN EL QUE LOS COMPONENTES A SEPARAR SE DISTRIBUYEN ENTRE DOS FASES, UNA INMÓVIL Y OTRA MÓVIL. EL PROCESO CROMATOGRAFICO SE DA COMO RESULTADO DE REPETIDOS PROCESOS DE SORCION-DESORCION DURANTE EL MOVIMIENTO DE LOS COMPONENTES DE LA MEZCLA ARRASTRADOS POR LA FASE MÓVIL A LO LARGO DEL LECHO ESTACIONARIO. TIPOS DE CROMATOGRAFÍA USADAS EN PURIFICACIÓN DE ENZIMAS: CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN EN GEL

10 MÉTODOS DE PURIFICACIÓN DE ENZIMAS INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS: LA INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS ES UN PROCESO EN EL QUE SE CONFINA O LOCALIZA A LA ENZIMA EN UNA REGIÓN DEFINIDA DEL ESPACIO, PARA DAR LUGAR A FORMAS INSOLUBLES QUE RETIENEN SU ACTIVIDAD CATALÍTICA Y QUE PUEDEN SER REUTILIZADAS REPETIDAMENTE. VENTAJAS DEL EMPLEO DE ENZIMAS INMOVILIZADAS: EL AUMENTO DE LA ESTABILIDAD DE LA ENZIMA LA POSIBLE REUTILIZACIÓN DEL DERIVADO, POR LO QUE DISMINUYEN LOS COSTES DEL PROCESO. LA POSIBILIDAD DE DISEÑAR UN REACTOR ENZIMÁTICO DE FÁCIL MANEJO Y CONTROL, ADAPTADO A LA APLICACIÓN DE LA ENZIMA INMOVILIZADA.

11 CONCLUSIÓN EN ESTA MONOGRAFÍA SE DIO A CONOCER LOS PRINCIPALES MECANISMO DE EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ENZIMAS, QUE SON LOS MISMOS PROCESOS QUE SE UTILIZAN PARA LA PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS. ENTRE TODOS LOS MÉTODOS PLANTEADOS, HAY UNO QUE ES ESPECÍFICO PARA ENZIMAS Y SE TRATA DE LA INMOVILIZACIÓN, QUE DEPENDIENDO DE LAS CONDICIONES ESTE PUEDE LLEGAR A SER EL QUE NOS DE MEJORES RESULTADOS CON RESPECTO A LA PUREZA. A PESAR DE ESTO, ESTE MÉTODO ES MUY RECIENTE Y NO ESTA TAN DESARROLLADO O ESTUDIADO EN PROFUNDIDAD COMO LOS OTROS MÉTODOS TENIENDO EN CUENTA LO ANTERIOR, CREEMOS QUE LA ELECTROFORESIS ES UNO DE LOS MEJORES MÉTODOS PARA LA PURIFICACIÓN.