Introducción a las columnas de HPLC

Transcripción

1 Introducción a las columnas de HPLC 1

2 En esta clase aprenderá lo siguiente: Los diferentes usos de las columnas de HPLC. Los materiales de relleno de las columnas. Cómo seleccionar el diámetro de partícula adecuado. Cómo seleccionar el diámetro interno de columna adecuado. Cómo seleccionar la longitud de columna correcta. 2

3 Columnas de HPLC Fase móvil desde la bomba Muestreador Precolumna Actúa sobre la muestra para atrapar partículas y componentes de muestras retenidos con fuerza. Las columnas varían en los siguientes aspectos: Longitud Diámetro interno Material de la fase estacionaria Tamaño de partícula de la fase estacionaria Al detector Columna analítica La columna analítica lleva a cabo la separación. 3

4 Columna - Acero inoxidable estándar Relleno de columna Capilar Frita de filtro de acero inoxidable Tamaño de poro de 2 um 4

5 Columna - Columnas de cartucho Soporte del cartucho de protección Cartucho de protección Frita PEEK/Junta Columna de cartucho Conexión del extremo 5

6 Materiales de relleno de columnas - Sílice Esférico Soles de sílice Xerogeles Irregular Las partículas tienen un diámetro de 3 a 10 mm en las columnas estándar. 6

7 Materiales de relleno de columnas - Fases enlazadas Poros Cadena de carbono con forma de cepillo H 3 C Si CH 3 Fase enlazada monomérica O OH R 1 R 1 Si Si Si-OH + Cl-Si-R Si-O-Si-R + HCl O O O R2 R2 7

8 Materiales de relleno de columnas - Fases enlazadas extensamente utilizadas HPLC de fase inversa C18 C8 C4 C1 Las columnas de HPLC más utilizadas Separaciones de proteínas CH 3-0-Si- R CH 3 Fenilo Dipolo débil - dipolo inducido Interacciones con analitos polares Intercambio iónico HPLC de fase normal o inversa CN Polaridad intermedia NH 2 HPLC de fase normal DEAE (dietilaminoetanol) QAE (aminoetilo cuaternario) Carboximetilo Exclusión de tamaño Glicerilpropilo Diol Separaciones de compuestos con polaridades muy diferentes 8

9 Materiales de relleno de columnas Rendimiento mejorado de desoxinucleósidos utilizando fase enlazada óptima LC: HP1090 Columnas: 4,6 x 50 mm, 3,5 µm Flujo: 1,0 ml / min. A: 0,1% TFA B: 90% MeOH: 10% H 2 O (0,1% TFA) Temp.: 30 C Detec.: 254 nm mau mau G C C T A G T 2 min A Zorbax SB-C18 92% A : 8% B 6 min Zorbax SB-CN 97,5% A : 2,5% B DAD1 A, Sig=254,16 Ref= DAD1 A, Sig=254,16 Ref= min 9

10 Materiales de relleno de columnas - Soportes de polímeros Estireno Divinil benceno Estireno-divinilbenceno CH = CH 2 CH = CH 2 - CH 2 - CH - CH- 2 - CH - CHC 2 - CH - CH CH = CH 2 - CH 2 - CH - CH- 2 - CH - CHC 2 - CH - CH Admiten: Fase normal e inversa Intercambiadores iónicos Cromatografía por exclusión de tamaño 10

11 Tamaño de partícula - Efecto en la eficacia N Teórico 5 -µm 3 -µm Número de platos/metro/ µm Velocidad de flujo Velocidad de flujo de la fase móvil, ml/min Columnas Zorbax SB-C8; d.i. de columna, 4,6 mm; ciprofloxacina; 22 C Fase móvil, 20% ACN/80% acuosa, 0,1% TFA 11

12 Tamaño de partícula - Efecto en la eficacia y la resolución 300SB-C8 (4,6 x 50 mm) 5µm Met Encefalina 2. Leu Encefalina 3. Angiotensina II 4. Neurotensina 5. RNasa 6. Insulina 7. Lisozima 8. Calmodulina 9. Mioglobina 10. Anihidrasa carbónica 300SB-C8 (4,6 x 50 mm) 3,5µm Tiempo de retención, min. 12

13 Número aproximado de platos (N) y volumen vacío (Vm) para columnas de 5 mm y 3,5 mm Si se reducen simultáneamente la longitud de la columna (N ) y el tamaño de partícula (N ), se podrá: Mantener la resolución Reducir el tiempo de análisis Reducir el uso de disolventes Tamaño de la Número de platos Volumen vacío Tamaño de partícula columna (N) (V m ) 4,6 x 250 mm 5-mm ,5 ml 4,6 x 150 mm 5-mm ,5 ml 4,6 x 150 mm 3.5-mm Resolución rápida ,5 ml 4,6 x 75 mm 3.5-mm Resolución rápida ,75 ml 4,6 x 50 mm 3.5-mm Resolución rápida ,5 ml 4,6 x 30 mm 3.5-mm Resolución rápida ,3 ml 4,6 x 15 mm 3.5-mm Resolución rápida ,15 ml 13

14 Aumentar la velocidad de análisis mientras se mantiene la resolución 5 mm 3,5 mm 5 mm 3,5 mm Dimensiones 250 x 4,6 mm 150 x 4,6mm 150 x 4,6 mm 75 x 4,6 mm Tiempo de análisis (min) Residuo de disolvente (ml) 40% 30 min 18 min 18 min 9 min Reducción 40% 30 ml 18 ml 18 ml 9 ml Reducción 50% Reducción 50% Reducción N Sin modificar 9% de diferencia 14

15 Presión Conseguir todo el potencial con mayor velocidad de flujo mau bar Rs 2,1 = 2,2 Rs 7,6 = 2,2 Velocidad de flujo 2 ml/min mau bar ml/min mau bar 0 0 Rs 2,1 = 2,1 Rs 7,6 = 2,2 30 seg 0,1 0,2 0,3 0,4 0, ,9 min 4 ml/min Zorbax SB-C18, 3,5 µm, 4,6 x 30 mm 15

16 4,6 mm Columnas con diámetro interno pequeño y muy pequeño d = 10 dmm p Convencional 1,00 ml/min 4,6 mm d = 5 dmm p Diámetro interno muy pequeño 2,1 mm o 1,0 mm Ventajas: d = 5 dmm p 100 mm Consumo reducido de disolvente. 200 mm Idóneas para análisis de trazas si la cantidad de muestra es limitado. Fácil conversión de velocidad de flujo para cambiar el método de columna analítica a columna de diámetro muy pequeño. Inconvenientes: 0,01 ml/min La instrumentación debe tener un volumen externo a la columna muy bajo. Las fritas se deben cambiar con más frecuencia. 16

17 Velocidades de flujo típicas d.i. de columna Flujo (partículas de 5 mm ) ml/min 4, ,0 0,4-0,8 2,1 0,2 0,4 1,0 0,05 0,09 17

18 Separación de alta resolución utilizando una columna de diámetro interno estrecho Columna ZORBAX 300SB-C8, 2,1 x 150 mm, 50 pmol BSA Tryptic Digest en 4M de urea, 50 ºC, 0,2 ml/min., UV-214 nm, A: 0,1% TFA en agua, B: 0,1% TFA en acetonitrilo/20% agua, Gradiente: 2-62% B en 70 min. 18

19 Adsorbance Absorbancia SB-C18 4,6 x 15 mm Longitud de columna - Adaptar la longitud a la resolución deseada los 7 componentes se descomponen en menos de 1 min DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,4 4,6 x 30 mm Condiciones: LC: Hewlett-Packard HP1100 Columnas: Zorbax SB-C18, 3,5 µm Fase móvil: 1 mm octano ácido sulfónico, Na sal, ph 2,5: ACN (80:20) DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,4 UV: 275 nm; flujo: 2,0 ml / min.; 70 C Vol. de inyección: 1 µl 4,6 x 50 mm Muestra: 1. Acetoaminofeno (4-acetoamidofenol) 2. Cafeína 3. 2-Ac2-Acetoamidofenol 4. Acetanilida 5. Aspirina (ácido acetilsalicílico) DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,4 6. Ácido salicílico 7. Fenacetina (acetofenetidina) 4,6 x 75 mm DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,4 4,6 x 150 mm DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360, min 19