HPLC a UPLC Como conseguir una buena transferencia de métodos? IV Reunión de Usuarios de Sistemas UPLC 24 Enero 2012, Madrid.

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1 HPLC a UPLC Como conseguir una buena transferencia de métodos? IV Reunión de Usuarios de Sistemas UPLC 24 Enero 2012, Madrid Waters Corporation 1

2 Como conseguir una buena transferencia de métodos? Escalado Geométrico Escalado Químico Herramientas disponibles para facilitar la transferencia Columns Selectivity Chart Acquity Columns Calculator 2012 Waters Corporation 2

3 Parámetros a Modificar Dimensiones de columna Acquity UPLC Mantener capacidad de separación entre columna HPLC y columna UPLC Capacidad de Separación: Relación entre Longitud y tamaño de partícula Columna habitual HPLC 4,6 x 150 mm, 5 µm Longitud de columna (L) = 150 mm = µm Tamaño de partícula (d p )= 5 µm L = = d p 5 Elegir columna UPLC con la misma relación L/dp que columna HPLC 2012 Waters Corporation 3

4 Escalado de HPLC a UPLC - L/dp constante 5 µm 150 mm Inyección = 5,0 µl Caudal = 0,2 ml/min Rs (2,3) = 2,28 HPLC 3,5 µm 100 mm Inyección = 3,3 µl Caudal = 0,3 ml/min Rs (2,3) = 2,32 2,5 µm 75 mm Inyección = 2,5 µl Caudal = 0,5 ml/min Rs (2,3) = 2,34 UPLC 1,7 µm 50 mm Inyección = 1,7 µl Caudal = 0,6 ml/min Rs (2,3) = 2, Waters Corporation 4

5 Escalado Geométrico Método inicial Temperatura: 30 C Caudal: 1.50 ml/min Analitos: Cafeina (100 µg/ml) Hidroquinidina (33 µg/ml) 3-Aminobenzofenona (39 µg/ml) Pesos moleculares: Menores de 500 Diluyente de muestra: DMSO Volumen de inyección: 10 µl Detección: Fase móvil: 254 nm A: 0.05% TFA en agua B: 0.05% TFA en acetonitrilo 2012 Waters Corporation 5

6 Ejemplo Características de la Columna inicial Fase estacionaria: XTerra MS C 18 Tamaño de partícula (dp):5 µm Diámetro interno (id): 4,6 mm Longitud (L): 150 mm Cálculo: L dp 150,000 µm = = 30,000 5 µm Calculamos la relación L/dp como medida de resolución Con este dato, seleccionamos las dimensiones adecuadas de la columna de UPLC 2012 Waters Corporation 6

7 Ejemplo Resultado Inicial Absorbance 254 nm Columna: 4,6 x 150 mm, 5 µm L/dp = Resolución (1,2) = 12 Resolución (2,3) = Minutos 2012 Waters Corporation 7

8 Ejemplo Gradiente inicial Etapa Tiempo Caudal %A %B Curva (min) (ml/min) Inicial 0 1, * , , , lineal 1 Regeneración 1 Re-equilibrado 2012 Waters Corporation 8

9 Ejemplo Características del Instrumento inicial Waters Alliance 2695 Solvent Manager Una única bomba Gradiente con mezcla en baja presión Waters Alliance 2695 Sample Manager Waters 2487 TUV a 254 nm 2012 Waters Corporation 9

10 Cálculo del volumen de inyección Cálculo del volumen de inyección Volumen de inyección inicial X Volumen de columna UPLC Volumen de columna HPLC Escalamos el volumen de inyección de 10 µl en una columna de 4,6 x 150 mm a una columna de 2,1 x 50 mm 10 µl x 3,14 x (0,105 cm)2 x 5 cm 3,14 x (0,23 cm) 2 x 15 cm = 10 µl x 0,17 2,49 = = 0,7 µl 10 µl x 0, Waters Corporation 10

11 Escalado del volumen de inyección El volumen de inyección debe ser menos del 5% del volumen de la columna. Intentar por debajo del 1% y determinar experimentalmente si se puede aumentar según condiciones cromatográficas. 4,6 x 150 mm 2,49 ml 20 µl inyección/2,49 ml = 0,8% 2,1 x 50 mm 0,17 ml 20 µl inyección/0,17 ml = 12% Si se inyecta demasiado, puede generare una mala forma de pico debido a sobrecarga 2012 Waters Corporation 11

12 Escalado geométrico del flujo Caudal = Caudal inicial x π x r2 col UPLC π x r 2 col HPLC Esta ecuación se reduce a: Caudal = Caudal inicial x d 2 Col. UPLC d 2 Col HPLC Escalamos el caudal de 1,5 ml/min en una columna de 4,6 x 150 mm a una columna de 2,1 x 50 mm 1,5 ml/min X 2,1 2 4,6 2 = 0,31 ml/min 2012 Waters Corporation 12

13 Escalado del gradiente inicial Etapa Tiempo (minutos) Caudal %A % B Curva Duración (min) Duración del gradiente (cv) Inicial 0 1, * , , , Lineal 1 Regeneración 1 Reequilibrado Waters Corporation 13

14 Duración del gradiente Expresado en función del volumen de columna Etapa 2: Tiempo de gradiente de 15 min a 1,5 ml/min en una columna de 4,6 x 150 mm Volumen de gradiente = Caudal x Tiempo = 1,5 ml/min x 15 min = 22.5 ml Volumen de columna = π x r 2 x L = 3,14 x 0,23 2 x 15 = 2,49 ml Duración del gradiente (cv) = Volumen de gradiente Volumen de columna Duración del gradiente = 22,5 ml 2,49 ml = 9,03 cv Nota: etapa 3 : 5 min = 3,01 cv y etapa 4 : 10 min = 6,02 cv 2012 Waters Corporation 14

15 Escalado del gradiente inicial Etapa Tiempo (min) Caudal %A %B Curva Tiempo de gradiente (min) Duración del gradiente (cv) Inicial 0 1, * , , , Waters Corporation 15

16 Escalado del gradiente inicial Manteniendo constante la duración del gradiente (cv) Etapa 2 en HPLC: 15 1,5 ml/min con una duración en volúmenes de columna de 9.03 cv Cálculo de etapa 2 en UPLC: Se mantiene constante la duración del gradiente en volúmenes de columna 9.03 cv Volumen de columna UPLC = π x r 2 x L = 3,14 x 0,105 2 x 5,0 = 0,17 ml Volumen de gradiente UPLC = duración del gradiente (cv) x Volumen de columna = 9,03 cv x 0,17 ml = 1,54 ml Tiempo de gradiente (min) = Volumen de gradiente / Caudal = 1,54 ml / 0,31 ml/min = 5 min 2012 Waters Corporation 16

17 Escalado del gradiente inicial Columna de 2,1 x 50 mm Ajustamos el tiempo manteniendo constante la duración del gradiente en volúmenes de columna Etapa Tiempo (min) Caudal* % A %B Curva Tiempo gradiente (min) Tiempo de gradiente (cv) Initial 0 0, * , ,0 9,03 3 6,67 0, ,67 3, , ,33 6,02 Ajustamos el flujo para una columna de 2,1 x 50 mm manteniendo constante la velocidad lineal (*Escalado geometrico del flujo) 2012 Waters Corporation 17

18 Curvas de van Deemter (PM<500) HETP (µm) µm SunFire C µm SunFire C µm ACQUITY UPLC HSS T3 1.7 µm ACQUITY UPLC BEH C Linear Velocity [mm/s] Diámetro Caudal de trabajo (ml/min) 4.6 mm mm mm Waters Corporation 18

19 Gradiente optimizado Seleccionamos el flujo en UPLC y ajustamos el tiempo manteniendo constante el número de volúmenes de columna Etapa Tiempo (min) Caudal % A % B Curva Tiempo de gradiente (min) Tiempo de gradiente (cv) Inicial 0 0, * ,61 0, ,61 9,03 3 3,48 0, ,87 3,01 4 5,22 0, ,74 6, Waters Corporation 19

20 Escalado Químico Que condiciona la selectividad de una columna? Fase enlazada Partícula Unión de la fase enlazada Endcapping 2012 Waters Corporation 20

21 Fase Enlazada Diferentes tipos: C18 - C8 CN Amide PFP... Diferentes enlaces: Trifuncional Monofuncional Embeeded Group Diferentes densidades 2012 Waters Corporation 21

22 Evolución del tamaño de partícula 70 s (inicio) recubrimiento pelicular no-poroso de 40µm psi platos/metro Columnas de 1m 10 min 70 s (finales) Partículas Irregulares micro-porosas de 10µm psi platos/metro Columnas de 3,9 x 300 mm 10 min 80 s hasta hoy Partículas esféricas micro-porosas de µm psi platos/metro Columnas de 3,9 x mm 10 min 2012 Waters Corporation 22

23 Fases Híbridas 2012 Waters Corporation 23

24 Evolución de las partículas 2012 Waters Corporation 24

25 End Capping Cl CH 3 Si CH 3 CH 3 Es un proceso que implica una segunda derivatización con trimetilclorosilano ( C1), que bloquea los grupos hidroxilo libres, haciéndolos inaccesibles a nuestros analitos CH 3 Si CH 3 CH 3 Primera Derivatización C18 Quedan ~ 50% OH Segunda Derivatización C1 Quedan ~ 40% OH Waters Corporation 25

26 Waters Selectivity Chart 2012 Waters Corporation 26

27 2012 Waters Corporation 27

28 2012 Waters Corporation 28

29 2012 Waters Corporation 29

30 Rellenos columnas BEH UPLC BEH C18 Relleno C18 trifuncional Primera elección en columna UPLC Máxima eficacia y óptima simetría de picos BEH C8 Relleno C8 trifuncional Nuevo proceso de endcapping El mayor rango de ph BEH Shield RP18 Relleno monofuncional Grupo polar embebido Selectividad alternativa BEH Phenyl Relleno Fenilo trifuncional Combinación única de partícula y ligando Amplio rango ph BEH HILIC Partícula BEH sin funcionalizar Relleno para bases muy polares BEH Amide Relleno trifuncional con grupo amida Modo Hilic para ácidos muy polares y azúcares Tipo Ligando Densidad Ligando Carga Carbono Endcapping 2012 Waters Corporation 30 Rango ph Trifuncional C µmol/m 2 18% Proprietary 1-12 Trifuncional C µmol/m 2 13% Proprietary 1-12 Monofuncional Grupo Polar Embebido 3.3 µmol/m 2 17% TMS 2-11 Trifuncional C 6 Fenil 3.0 µmol/m 2 15% Proprietary 1-12 Sin ligando Trifuncional Amide 7.5 µmol/m 2 12% None 2-11

31 Rellenos columnas HSS UPLC HSS T3 Tecnología T3 de enlazado y endcapping Mayor retención para compuestos polares HSS C 18 Alta cobertura, relleno C18 trifuncional Universal, relleno C18 de altas prestaciones Proceso de endcapping patentado para picos óptimos HSS C 18 SB SB: Selectividad para Bases Sin encapping: selectividades silanólicas alternativas Diseñada para desarrollo de métodos Tipo Ligando Densidad Ligando Carga Carbono Endcapping Rango ph HSS PFP Selectividad excepcional para isómeros posicionales, compuestos halogenados y compuestos polares HSS CN Estable, compatible con RP & NP, química CN reproducible Baja hidrofobicidad y selectividad única comparada con ligando C18 Trifuncional C µmol/m 2 11% Proprietary 2-8 Trifuncional C µmol/m 2 15% Proprietary 1-8 Trifuncional C µmol/m 2 8% None 2-8 Trifuncional Propilfluorofenil Monofuncional Diisopropil Ciano 3.3 µmol/m 2 7.5% None µmol/m 2 5.5% None Waters Corporation 31

32 Rellenos columnas CSH UPLC CSH C18 Media/alta cobertura trifuncional C 18 Superior forma pico para productos básicos en fases móviles de baja fuerza iónica Menor retención para bases (vs. BEH C 18 ) CSH PFP Fluorofenil Forma pico excepcional y baja retención para bases con grandes diferencias en selectividad Elevada reproducbilidad CSH Fenil Hexil Excepcional forma de pico para compuestos básicos Selectividad complementaria para compuestos aromáticos Tipo Ligando Densidad Ligando Carga Carbono Endcapping Rango ph Trifuncional C µmol/m 2 15% Proprietary 1-11 Trifuncional Propilfluorofenil 2.3 µmol/m 2 10% None 1-8 Trifuncional C 6 Fenil 2.3 µmol/m 2 14% Proprietary Waters Corporation 32

33 UPLC Columns calculator 2012 Waters Corporation 33

34 Condiciones Cromatográficas HPLC Condiciones Cromatográficas HPLC : Columna: XTerra MS C 18 4,6 x 150 mm, 5 µm Fase Móvil A: 0,1% TFA en agua Fase Móvil B: 0,08% TFA en acetonitrilo Caudal: 1,0 ml/min Perfil Gradiente: Tiempo Perfil (min) %A %B curva 0, , , , , , Vol. inyección: 10 µl Conc. muestra: 100 µg/ml Temperatura: 40 o C Detección: 330 nm Velocidad adquisición datos: 5 pts/sec Constante Tiempo: 1,0 Instrumento: Módulo Separación Alliance 2695 con 2996 PDA 2012 Waters Corporation 34

35 Método HPLC original: Derivados de ácido cafeico en Echinacea Purpurea P c = AU Minutos Nombre Tiempo Retención Resolución USP 1. Acido caftárico 5,71 2. Acido clorogénico 7,07 4,20 3. Cinarina 13,96 21,19 4. Equinacosida 16,54 10,16 5. Acido cicoico 20,32 17, Waters Corporation 35

36 Opción 1: Escalado geométrico del gradiente a la misma velocidad lineal de HPLC AU HPLC P c = 94 Retention Time USP Resolution Name caftaric acid 5.71 chlorogenic acid cynarin echinacoside cichoic acid AU Minutes UPLC P c = Minutos Retention Time USP Resolution Name caftaric acid 1.99 chlorogenic acid cynarin echinacoside cichoric acid Waters Corporation 36

37 Opción 2: Escalado geométrico del gradiente a velocidad lineal de UPLC AU HPLC P c = 94 Retention Time USP Resolution Name caftaric acid 5.71 chlorogenic acid cynarin echinacoside cichoic acid Minutos AU UPLC P c = Minutos 2012 Waters Corporation Retention Time USP Resolution Name caftaric acid 0.71 chlorogenic acid cynarin echinacoside cichoric acid

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