Claves en el Desarrollo de Métodos LC Consejos prácticos

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1 Claves en el Desarrollo de Métodos LC Consejos prácticos 2014 Waters Corporation 1

2 Métodos problemáticos Consecuencias de un método mal desarrollado Calidad o o o Coste Datos no fiables, necesidad de re-analizar muestras Resultados fuera de especificaciones, investigaciones Dificultad para transferir métodos Un buen método le proporciona un buen resultado, siempre! o o o o Solicitudes de registro rechazadas, auditorías Retrasos en obtención de resultados/liberación de lote y complejidad adicional en el proceso regulatorio Tiempo necesario para volver a desarrollar el método, para revalidarlo y volver a solicitar el registro Desperdicio de recursos tiempo del analista, consumibles y tiempo de funcionamiento del instrumento 2014 Waters Corporation 2

3 Aspectos a considerar Separación Detección Evaluación de datos Transferencia Método robusto Mi sistema funciona correctamente? Utilizo la columna adecuada? Estoy separando todos los analitos? La columna está en buen estado? Estoy viendo todos los picos? Estoy identificando correctamente los picos? Hay alguna forma mejor de hacer el seguimiento de los picos? Estoy cansado de inyectar patrones! Los picos son puros? El método cumplirá los criterios? Dónde están los datos? Mi sistema es suficientemente flexible? Fallará en QC? Se podrá transferir fácilmente? Obtendré resultados exactos? El método es robusto? Es reproducible? Los lotes son muy largos! 2014 Waters Corporation 3

4 Esquema Métodos robustos Transferencia Separación Evaluación de datos Detección 2014 Waters Corporation 4

5 Separar todos los analitos lo más rápido posible CSH C 18 ph 3, ACN I A P Fe D O P: 1-pyrenesulfonic acid Fe: fenoprofen D: diclofenac I: Imipramine A: Amitriptyline Fl: Flavone O: Octanophenone Fl CSH Phenyl-Hexyl ph 10, MeOH Fe P D Fl O I A No sabía que podía trabajar con ph altos Solo tiene que usar una columna de partícula híbrida! Minutes Maximice la selectividad combinando distintas columnas, modificadores orgánicos y ph 2014 Waters Corporation 5

6 AU AU AU AU Una columna C18 genérica no es suficiente 0.05 CSH C CORTECS C 18 + Mayor número de picos resueltos CSH Phenyl Hexyl HSS PFP Pruebe distintas columnas, ligandos y tecnologías de partícula para identificar la mejor separación más rápido Minutes * Masa principal del pico 2014 Waters Corporation 6

7 Intensity Intensity Intensity AU Qué pasa si hay co-eluciones? Detección UV Paroxetine + related compounds Desarrollé un método... Había una coelución y tuve que empezar de nuevo! Minutes 5x10 8 m/z x x * Masa principal del pico m/z m/z Minutes Utilice detectores complementarios: la detección de masas combinada con la detección UV premite identificar coeluciones rápidamente 2014 Waters Corporation 7

8 AU Acetone Naphthalene Acenaphthene AU AU Acetone Acetone Naphthalene Naphthalene Acenaphthene Acenaphthene AU AU Acetone Acetone Naphthalene Naphthalene Acenaphthene Acenaphthene AU Acetone Naphthalene Acenaphthene Comprobar si la columna funciona correctamente... Registrar el historial de la columna e-cord Usar un patrón certificado para evaluar el rendimiento de las columnas usadas Neutrals Quality Control Reference Material (QCRM) Failing Column Normal Operation Failing Column Minutes Minutes 0.04 Normal Operation Failing Column Normal Operation El mejor procedimiento es usar una columna nueva caracterizada en su propio sistema Waters Corporation 8

9 AU Intensity Verificar la retención de los compuestos Suplemento vitamínico con Glucosamina y Vitamina D Glucosamina Altamente Glucosamina polar Altamente polar Utilice Fase el reversa modo de separación Modo HPLC adecuado HILIC HILIC para compuestos altamente polares (in void) Vitamina D3 Altamente apolar Fase Reversa HPLC Minutes 2014 Waters Corporation 9

10 Esquema Métodos robustos Transferencia Separación Evaluación de datos Detección 2014 Waters Corporation 10

11 Intensity Memantine Sufadimethoxine Reserpine Terfenadine AU Sulfadimethoxine Reserpine Terfenadine Detectar todos los analitos Detección UV x10 7 6x10 7 4x10 7 2x10 7 Detección de masas No se pierda nada utilice técnicas de detección complementarias (UV y MS) Minutes * Masa principal del pico La memantina no tiene cromóforos y requiere técnicas de detección alternativas a la UV 2014 Waters Corporation 11

12 AU Patrones individuales para identificar cada pico secuencias de análisis largas metoprolol paperavine bromazepam medazepam doxepin oxazepam loazepam amitriptyline temazepam clomipramine diazepam patrones en 11 inyecciones distintas solo con detección UV (1hr 39 min) vs. 11 patrones en una sola inyección con detección UV y MS (9 min) Ahorro del 91% de tiempo Ahorre tiempo obteniendo más información en una inyección Minutes * Masa principal del pico 2014 Waters Corporation 12

13 AU AU Seguir cada compuesto a lo largo del proceso de desarrollo ph 3 Los picos se mueven y no puedo indentificarlos ph 9.5 Realice el seguimiento de sus picos de manera fácil y rápida con información MS * Masa principal del pico Minutes 2014 Waters Corporation 13

14 Identificar correctamente los picos * Masa principal del pico Confirme la identidad de los picos con Empower analizando datos MS y UV conjuntamente 2014 Waters Corporation 14

15 Esquema Métodos robustos Transferencia Separación Evaluación de los datos Detección 2014 Waters Corporation 15

16 Evaluación consistente de los datos Integración tradicional Integración ApexTrack La integración Apex Track de Empower permite realizar una integración fácil y reproducible de picos coeluidos de manera automática Waters Corporation 16

17 Verificar los criterios de calidad de la separación Observando los cromatogramas creía haber elegido las mejores condiciones, pero no lo eran No haga suposiciones! Utilice los campos personalizados de Empower para identificar las mejores condiciones 2014 Waters Corporation 17

18 Verificar que no hay coeluciones Apex Los picos parecían homogéneos pero en QC detectaron que no lo eran. Verifique la homogeneidad de los picos utilizando los datos UV y MS en Empower Leading Trailing 2014 Waters Corporation 18

19 Recuperar los datos Organice los datos por proyectos Consultas basadas en cualquier combinación de metadatos Comodines Rangos de datos Base de datos relacional Realicé mis experimentos la semana pasada cuáles eran las mejores condiciones? 2014 Waters Corporation 19

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21 Transferir métodos: Entre equipos - Entre laboratorios La clave para una buena transferencia de métodos son un método robusto y una validación hecha en distintos instrumentos Pequeñas diferencias en la configuración o el rendimiento entre sistemas puede provocar variaciones en los resultados El desgaste del instrumento o la columna Cambios en el tamaño y la longitud de la tubería Contaminación 2014 Waters Corporation 21

22 AU Acetone Naphthalene Acenaphthene AU Acetone Naphthalene Acenaphthene Verificar el funcionamiento del sistema Neutrals Quality Control Reference Material (QCRM) Posibles problemas: Minor Leak System Pressure: ~6400 psi Normal Operation System Pressure: ~ 6600 psi Fugas Conexiones gastadas Columnas envejecidas Contaminación cruzada Celda sucia Errores en la fase móvil Burbujas de aire Otros Minutes Desarrolle los métodos y transfiéralos en sistemas que estén funcionando correctamente 2014 Waters Corporation 22

23 AU Equipos flexibles Evitar cambios en la configuración del sistema Caffeine metabolites ACQUITY H-Class (como HPLC) 4.6 x 100mm 3.5µm Xterra MS Phenyl Flow rate: 1mL/min Water/Acetonitrile/100mM amm. bicarb. ph 10 UV detection at 280 nm Minutes Tioconazole and Related Compounds ACQUITY H-Class (como UPLC) 2.1 x 75mm 1.7 µm ACQUITY UPLC CSH C 18 Flow rate: 0.6 ml/min ACN: MeOH: Water (44:40:28) UV detection at 254nm Reduzca la variabilidad utilice un solo sistema tanto para métodos HPLC como para métodos UPLC 2014 Waters Corporation 23

24 Optimizar la robustez para una mejor transferencia de métodos 5 µm 150 mm L/d p = 30,000 Flow rate = 0.2 ml/min Rs (2,3) = 2.28 Desarrollé un método en HPLC, y ahora no puedo transferirlo porque no hay una columna UPLC equivalente 3.5 µm 100 mm L/d p = 28,571 Flow rate = 0.3 ml/min Rs (2,3) = µm 50 mm L/dp = 29,412 Flow rate = 0.6 ml/min Rs (2,3) = 2.29 Las químicas de columna BEH/CSH/HSS son directamente escalables Desarrolle métodos con químicas escalables para facilitar las transferencias de métodos 2014 Waters Corporation 24

25 Esquema Métodos robustos Transferencia Separación Evaluación de datos Detección 2014 Waters Corporation 25

26 Finalmente un método robusto ACQUITY UPLC H-Class ACQUITY CSH C x 50 mm, 1.7 µm Column at 30 C 0.1% Formic acid, ph % ACN in Water over 5 min Ziprasidone peroxide degradation Utilice Empower Method Validation Manager (MVM) para automatizar los ensayos de validación 2014 Waters Corporation 26

27 Validación: un trabajo tedioso Creación de la secuencia de muestras Adquisición y procesamiento de datos Cálculo de resultados estadísticos Compilación de informes Preparación de patrones y muestras Method PNT de Validation validación de métodos Manager corporativo Gestión de los datos 2014 Waters Corporation 27

28 Crear un método robusto es solo cuestión de aplicar estos trucos y consejos? 2014 Waters Corporation 28

29 Métodos robustos - Equipo fiable ACQUITY UPLC H-Class para desarrollos de método rápidos y fiables Sistema fiable y de calidad Métodos HPLC o UPLC Detectores ACQUITY PDA, TUV, FLR, ELSD, RI, QDa Flexibilidad modular Facilidad de uso Bomba cuaternaria Composiciones de fase móvil constantes con la tecnología Auto Blend Válvula selectora de solvente opcional (hasta 9 líneas) Gestor de columnas Hasta 6 columnas Evite tener que montar y desmontar columnas Químicas de 5µm a sub-2µm Diferentes modos de calentamiento para minimizar problemas de transferencia 2014 Waters Corporation 29

30 AU AU Fiabilidad en el control de las condiciones cromatográficas Inyección # ph Injección #2 ph Minutes * Masa en la base del pico Pequeños cambios en la preparación de la fase móvil pueden afectar a la robustez del método 2014 Waters Corporation 30

31 El sistema debe controlar la composición de la fase móvil de manera exacta La tecnología Auto Blend está integrada en el sistema ACQUITY H-Class 95% 0% 45% 50% Agua Acetonitrilo Agua Acetonitrilo 5% 0% 5% 0% 1% FA 1% NH 4 OH 1% FA 1% NH 4 OH 100% Agua 0% Acetonitrilo 0.05% Ácido Fórmico 50% Agua 50% Acetonitrilo 0.05% Ácido Fórmico 2014 Waters Corporation 31

32 Incorporar un detector de masas Detector ACQUITY QDa Detección de masas m/z 30 a 1250 Mantenimiento mínimo ESI ± Pre-optimizado Mínima intervención del usuario Pulsar el botón de encendido Rápida puesta a punto Listo! Si puede usar un PDA, puede usar un QDa! Modular, ocupa poco espacio QDa PDA 2014 Waters Corporation 32

33 Propranolol/acenaphthene [Alpha] Ligand Density [µmol/m2] Evaluar la columna a elegir Waters es fabricante primario de partículas de sílice e híbridas desde la materia prima hasta el producto acabado Se fabrican lotes pequeños de 1-2 Kg para monitorizar cuidadosamente los parámetros que tienen un impacto en la variabilidad del proceso ACQUITY UPLC BEH C 18 Coverage UCL LCL Batch Gráfico del proceso de control de 85 lotes de columnas ACQUITY UPLC BEH C 18 Base/Neutral Selectivity UCL Minimice el riesgo de variabilidad de un método desarrollando columnas de calidad! Batch LCL 2014 Waters Corporation 33

34 AU AU AU Métodos válidos a largo plazo Pruebe tres columnas con el mismo relleno, de lotes distintos, utilizando los kits de validación de métodos para validar a fiabilidad del método a largo plazo Lote Lote Lote Minutes 2014 Waters Corporation 34

35 Proceso: Optimizar el desarrollo de métodos robustos Protocolo clásico: Un factor cada vez Protocolo sistemático Quality by Design (QbD) - Columna arbitraria - Para una separación rápida y poco desarrollada - Configuración predefinida - Explorar/probar/optimizar - Enfoque estadístico - Para métodos rutinarios Pros - Rápido - Fácil de configurar - Proceso controlado - Equilibrio rapidez / robustez - Exhaustivo - Conocimiento de la robustez - Gestión del riesgo Contras - Puede no ser robusto - Poca trazabilidad del proceso - Pueden no probarse las mejores condiciones - Puede necesitar más optimización - Necesidad de software QbD - Más procesamiento - Los resultados se tienen que confirmar Mayor garantía sobre la robustez del método 2014 Waters Corporation 35

36 Qué es un protocolo sistemático? Defina la muestra y los criterios de separación Preparación de muestras Exploración rápida CSH C 18 Gradiente estándar ph ácido/básico ph ácido ph básico Procesar de datos en Empower Elija el mejor resultado basado en los criterios No se retienen? Utilizar método HILIC Screening CORTECS C18+ HSS T3 CORTECS C18+ HSS T3 HSS C Columnas ACN y MeOH CSH Phenyl- Hexyl (ACN) BEH C18 CSH Phenyl- Hexyl (MeOH) BEH C18 HSS PFP opcional Procesar de datos en Empower Elija el mejor resultado basado en los criterios Optimización Gradiente Temperatura Otros parámetros 2014 Waters Corporation 36

37 Qué hace Quality by Design? Software Fusion Method Development Enfoque estadístico en el diseño de experimentos para el desarrollo de métodos Plantillas sencillas Automatiza la creación de sample sets y method sets en Empower Facilita el análisis de los datos Beneficios: Identifique las áreas de cumplimiento del rendimiento del método y las limitaciones (riesgo) Robustez del modelo Descubra los parámetros de variabilidad y los límites de cumplimiento [1] Defina el experimento Seleccione las variables experimentales [2] Desarrolla el espacio de conocimiento Genera el diseño del experimento [3] Establece el espacio de diseño Define las condiciones óptimas Pre-defina los objetivos de separación Identifica el rendimiento medio del método Identifica un espacio de operación robusto 2014 Waters Corporation 37

38 COndiciones de máximo rendimiento del método El gráfico muestra las regiones donde se cumplen los criterios especificados de rendimiento del método El método funciona en estas dos regiones 2014 Waters Corporation 38

39 Rendimiento y robustez del método óptimos Espacio de diseño de la robustez del método 2014 Waters Corporation 39

40 Imp B Imp A Lastpeak AU API API AU El proceso de desarrollo de métodos es muy largo HPLC columnas - Gradientes Composiciones de la fase móvil HPLC: 45 días Minutes UPLC: 2 días ACQUITY UPLC con software Fusion columnas Gradientes - Composiciones de la fase móvil - ph - Flujo Minutes Combine UPLC y Fusion para obtener la máxima información en el mínimo tiempo! 2014 Waters Corporation 40

41 Optimizar los elementos clave FLEXIBILIDAD INSTRUMENTAL: Transferencia Sistema H-Class y químicas escalables SOLUCIONES INTEGRALES DE Waters Métodos robustos Métodos robustos y más rápidos QUÍMICAS ROBUSTAS Y Separación FIABLES: Máxima selectividad TRATAMIENTO, EVALUACIÓN Y RECUPERACIÓN Evaluación de DE los DATOS: datos Empower3 COMBINAR UV y MS PARA Detección OBTENER LA MÁXIMA INFORMACIÓN: ACQUITY QDa 2014 Waters Corporation 41

42 Waters Xevo TQ MS 2014 Waters Corporation 43