" Desarrollo de Métodos LC robustos: la combinación óptima columna-plataforma instrumental HPLC/UHPLC/UPLC "

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1 " Desarrollo de Métodos LC robustos: la combinación óptima columna-plataforma instrumental HPLC/UHPLC/UPLC " Presentadora: Olatz Mitxelena Chat: Elena Chiquero Dpto. Columnas y Accesorios 2015 Waters Corporation 2

2 Comunicación a través del chat Q&A (durante la presentación y/o turno de preguntas tras presentación) Encuesta al finalizar la sesión 2015 Waters Corporation 3

3 Maximizar prestaciones Columnas Rs = N 4 α 1 α k k + 1 Contribuciones mecánicas Baja dispersión: combinación óptima instrumento Velocidad lineal óptima Morfología de la partícula Disminuir el tamaño de partícula Columnas bien empaquetadas Contribuciones físico-químicas Fases enlazadas complementarias Naturaleza de los substratos Trabajar a ph extremos Aumentar la retención 2015 Waters Corporation 4

4 Introducción: plataformas LC actuales Desde 2004 la tecnología LC ha evolucionado con gran contribución de Waters en constante innovación teniendo como base las necesidades de nuestros clientes para la obtención de resultados robustos, fiables y en cumplimiento de las normativas 2015 Waters Corporation 5

5 Introducción: plataformas LC actuales Alliance HPLC ACQUITY Arc ACQUITY UPLC H-Class 2015 Waters Corporation 6

6 Contribución a la dispersión Columna Cromatográfica: tamaño de partícula y geometría Sistema Cromatográfico: diseño y diámetro de tubos, fluídicas inyector y celda detector 2015 Waters Corporation 7

7 Contribución del Instrumento 2015 Waters Corporation 8

8 Contribución Instrumento σ v, total = σ v, injector + σ v, precolumn + σ v, column + σ v, postcolumn + σ v,detector + τ detector F Volumen inyección + Ensanchamiento inyector Tubo Entre inyector Y columna Volumen columna + Diseño columna Tubo entre columna y detector Ensanchamiento Celda detector + tubos Ensan- Chamiento en tiempo en detector (Veloc. adquisición; Constante tiempo) Avances y desarrollo de ingeniería han reducido dispersión Diseño inyector Volúmen reducido tubos Células de detector de dispersión reducida 2015 Waters Corporation 9

9 Contribución Instrumento Alliance HPLC ACQUITY Arc ACQUITY UPLC H-Class < 12 µl µl > 30 µl 2015 Waters Corporation 10

10 Contribución Instrumento: Columna CORTECS 2.1 x 50 mm 1.6 µm 5.5 µl band spread 1. Acetone, 2. Naphthalene, 3. Acenaphthene N 5σ : 18, µl band spread -17% N 5σ : 14, µl band spread -33% N 5σ : 12, Minutes 2015 Waters Corporation 11

11 Contribución de la Columna (ecuación de van Deemter): -Tamaño de partícula dp -Longitud de Columna L -Diámetro interno de columna I.D Waters Corporation 12

12 Contribución Columna: tamaño de partícula dp Disminuir tamaño de partícula conlleva aumentar eficacia (clave Empaquetamiento) estilizado de picos Consecuencia: presiones mayores 10 µm 5 µm 3 µm 2.5 µm 1.7 µm Ecuación de van Deemter: eficacia en función de la velocidad lineal 2015 Waters Corporation 13

13 Contribución Columna: tamaño de partícula dp 2015 Waters Corporation 14

14 Contribución Columna: longitud de columna L Aumentar longitud de columna conlleva aumentar eficacia Consecuencia: tiempos de retención mayores y mayores presiones 2015 Waters Corporation 15

15 Contribución Columna: diámetro interno de columna ID El diámetro interno de la columna incide en el caudal de trabajo: para mantener velocidad lineal, disminuir diámetro interno conlleva a trabajar a caudales menores 2015 Waters Corporation 16

16 Influencia dispersión de Sistema en ID: Sistema HPLC ~50 µl 0.06 Efficiency AU R s(1,2) =3.6 CORTECS HILIC, 2.7 µm 4.6 x 50 mm AU R s(1,2) =2.5-33% 4800 CORTECS HILIC, 2.7 µm 3.0 x 50 mm % 0.04 AU 0.02 R s(1,2) = Minutes 2900 CORTECS HILIC, 2.7 µm 2.1 x 50 mm 2015 Waters Corporation 17

17 Contribución Columna: diámetro interno de columna ID Mayor impacto de la dispersión del sistema en diámetros internos menores 2015 Waters Corporation 18

18 Combinar Instrumento y Columna: Separación cromatográfica óptima Combinación Sistema LC y Columna adecuados 2015 Waters Corporation 19

19 Combinar Instrumento y Columna: Separación cromatográfoca óptima Seleccionar el tamaño de partícula adecuado a la dispersión que generará el Sistema LC 2015 Waters Corporation 20

20 Combinar Instrumento y Columna: Separación cromatográfoca óptima Adecuar el tamaño de partícula con el ID de la columna que mejor se ajuste al sistema cromatográfico 2015 Waters Corporation 21

21 Combinar Instrumento y Columna: Separación cromatográfoca óptima Seleccionar el caudal de trabajo para la velocidad lineal óptima para maximizar la eficacia de la columna (van Deemter) 2015 Waters Corporation 22

22 Combinar Instrumento y Columna: Separación cromatográfoca óptima El sistema LC debe ser capaz de trabajar contra la presión resultante de las condiciones óptimas seleccionadas en función de la columna 2015 Waters Corporation 23

23 Impacto en prestaciones para combinaciones inadecuadas Sistema y Columna HPLC UHPLC 2.1 mm ID 1.6 μm 50mm length AU AU AU UPLC Minutes Minutes Minutes 3.0 mm ID 2.7 μm 50mm length AU AU AU Minutes Minutes Minutes 4.6 mm ID 2.7 μm 50mm length AU AU AU Minutes Minutes Minutes 2015 Waters Corporation 24

24 Combinación adecuada Sistema y Columna = Mejor Prestación Cromatográfica 2015 Waters Corporation 25

25 Combinar Sistema LC y Columna La calidad de la separación cromatográfica queda definida por la combinación de Instrumento y Columna Caudal y presión no son causa sino consecuencia de la optimización de las condiciones de la separación cromatográfica Sistema HPLC UHPLC UPLC Dispersión > 30 μl μl <12 μl Tamaño Partícula 3.5 μm, 5 μm, 10 μm (Prep) 2.x μm, 3.5 and 5 µm < 2 μm Presión rutina < 4000 psi < psi < psi (I-Class) ID Columna 4.6 mm (3.0 mm) 3.0 mm (2.1 mm) 2.1mm (1.0 mm) Longitud Columna mm 50 mm - 100mm 150 mm 2015 Waters Corporation 26

26 Maximizar prestaciones Columnas Rs = N 4 α 1 α k k + 1 Contribuciones mecánicas Baja dispersión: combinación óptima instrumento Velocidad lineal óptima Morfología de la partícula Disminuir el tamaño de partícula Columnas bien empaquetadas Contribuciones físico-químicas Fases enlazadas complementarias Naturaleza de los substratos Trabajar a ph extremos Aumentar la retención 2015 Waters Corporation 27

27 Tecnología Partículas Tecnología BEH Tecnología HSS Tecnología CSH Tecnología CORTECS Solid-Core Estabilidad ph sin precedentes Versatilidad fase móvil y temperatura Escalabilidad incomparable UPLC a HPLC Máxima Retención Selectividad partícula y ligando Escalabilidad incomparable UPLC a HPLC Capacidad de carga excepcional Forma de pico superior para analitos básicos Escalabilidad incomparable UPLC a HPLC Mayor eficacia y resolución Productividad mejorada a resolución similar Mayor prestación a igual presión TODAS disponibles en tamaños de partícula HPLC, UHPLC, y UPLC 2015 Waters Corporation 28

28 La gama más amplia de columnas LC Siete partículas base BEH [Ethylene Bridged Hybrid]: 125Å, 130Å, 200Å y 300Å CSH [Charged Surface Hybrid] y HSS [High Strength Silica] Sílica Núcleo Sólido Selección amplia y creciente de químicas de columna 19 fases estacionarias escalables BEH 130Å C 18, C 8, Shield RP18, Phenyl, HILIC y Amide BEH 300Å C 18 y C 4 HSS C 18, T3, C 18 SB, PFP y CN CSH C 18, Fluoro-Phenyl y Phenyl-Hexyl Sílica Núcleo sólido C18, C18+, HILIC Soluciones certificadas aplicaciones específicas SEC, AAA, OST, PST, PrST y Glycan Transferencia entre HPLC y UPLC XBridge HPLC/UHPLC y ACQUITY UPLC BEH XSelect HSS HPLC/UHPLC y ACQUITY UPLC HSS XSelect CSH HPLC/UHPLC y ACQUITY UPLC CSH CORTECS UPLC y UHPLC Guarda columnas VanGuard 2015 Waters Corporation 29

29 Constante crecimiento rango Selectividades ACQUITY UPLC HSS C18 SB XSelect HSS C18 SB ACQUITY HSS PFP XSelect HSS PFP ACQUITY UPLC HSS CN XSelect HSS CN ACQUITY UPLC CSH Fluoro-Phenyl XSelect CSH Fluoro-Phenyl ACQUITY BEH C8 XBridge C8 ACQUITY UPLC BEH Phenyl XBridge Phenyl ACQUITY UPLC CSH Phenyl-Hexyl XSelect CSH Phenyl-Hexyl ACQUITY UPLC BEH Shield RP18 XBridge Shield RP18 CORTECS C18+ ACQUITY UPLC HSS T3 XSelect HSS T3 ACQUITY UPLC BEH C18 XBridge C18 CORTECS C18 ACQUITY HSS C18 XSelect HSS C18 ACQUITY UPLC CSH C18 XSelect CSH C Waters Corporation 30

30 Gama amplia Selectividades ,4 5 5 BEH C 18 BEH C 8 BEH Shield RP18 BEH Phenyl 5 CSH Phenyl- Hexyl CSH Fluoro-Phenyl 5 CSH C 18 Conditions : Columns: 2.1 x 50 mm Mobile Phase A: 0.1% CF 3 COOH in H 2 O Mobile Phase B: 0.08% CF 3 COOH in ACN Flow Rate: 0.5 ml/min Gradient: Time Profile Curve (min) %A %B Injection Volume: 1.0 µl Sample Diluent: 50:50 H 2 O: MeOH with 0.05% CF 3 COOH Sample Conc.: 100 µg/ml Temperature: 40 o C Detection: 330 nm Sampling rate: 40 pts/sec Time Constant: 0.1 Instrument: Waters ACQUITY UPLC, with ACQUITY UPLC TUV HSS CN HSS PFP HSS T3 HSS C 18 HSS C 18 SB Compounds 1. Caftaric acid 2. Chlorogenic acid 3. Cynarin 4. Echinacoside 5. Cichoric acid Minutes 2015 Waters Corporation Comparative separations may not be representative of all applications 31

31 Avances en Tecnología de partículas: Partículas Porosas vs. Núcleo Sólido 2.5 µm FIB SEM Images 1.6 µm 2.7 µm Solid- Core Particle Solid- Core Particle Fully Porous Solid-Core Solid-Core ρ = core diameter / particle diameter Attribute CORTECS ρ = 0 fully porous particle ρ = 1 nonporous particle ρ 0.7 Particle Size 1.6 µm, 2.7 µm Pore Volume 0.26 cm³/g Pore Size 90 Å Surface Area 100 m²/g 2015 Waters Corporation 32

32 Nuevo! Guarda columnas VanGuard Hasta el momento: Optimizadas para columnas ACQUITY UPLC Únicamente en 2.1 mm I.D. Tamaño partícula Sub 2-µm NUEVAS Vanguard HPLC Optimizadas para columnas HPLC/UHPLC 2.1 x 5 mm; 3.9 x 5 mm Tamaños de partícula 2.5/2.7 µm para columnas XP y UHPLC Tamaños de partícula µm para columnas HPLC 2015 Waters Corporation 33

33 Conclusiones La combinación óptima columna e instrumento: Maximiza eficacia cromatográfica Reduce efectos extra-columna que degradan la prestación cromatográfica o Sensibilidad o Eficacia o Resoución Recomendación columna óptima según plataforma instrumental basada en la Dispersión HPLC (4.6 mm i.d) (>3 µm tamaño de partícula) UHPLC (3.0 mm i.d.) (2 µm - 3 µm tamaño de partícula) UPLC (2.1 mm i.d.) (< 2 µm tamaño de partícula) Columnas XBridge BEH, XSelect HSS, XSelect CSH XP 2.5 µm y CORTECS 2.7 µm compatibles con plataformas HPLC, UHPLC y UPLC Maximizan eficacia, prestación y productividad en cualquier sistema LC Amplio rango (escalabilidad) de químicas, longitudes de columna y diámetros internos 2015 Waters Corporation 34

34 Promoción Vigente 2015 Waters Corporation 35

35 GRACIAS! 2015 Waters Corporation 36