TRANSFIERA SUS MÉTODOS DE HPLC CONVENCIONAL A FAST LC

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1 TRANSFIERA SUS MÉTODOS DE HPLC CONVENCIONAL A FAST LC Tecnologias para mejorar los tiempos de análisis y la productividad Julián de la Mata 13 de Diciembre de

2 Agenda En este eseminario hablaremos sobre: - Pasos a seguir para convertir un método de HPLC convencional en un método rápido. - Aumento de la eficacia de la separación con columnas UHPLC (superficial y totalmente porosas ) - Guía de selección de columnas para el desarrollo de métodos rápidos 2

3 Pasos a seguir para convertir un método de HPLC convencional en un método rápido. Consideraciones acerca de la justificación de un método rápido: revalidaciones/beneficios Consideraciones acerca de las columnas: fase estacionaria, dimensiones, tecnología de partículas Consideraciones del método: Cálculos de conversión de métodos Fase móvil, ph, temperatura Consideraciones acerca del instrumento. Objetivos perseguibles: mantener la resolución,evitar la dispersión de picos, anticipación de limitaciones de presión o flujo. 3

4 Beneficios de la Fast LC en la calidad de los analisis/control de calidad Objetivos primarios Respuesta a la fabricación producción más rápida Posibilidades de expansión analizar más productos por día Manejar mayor carga de muestras con menos personal Reducir costo por análisis (carga de trabajo, gastos generales) Objetivos secundarios Reducir consumo de disolventes (compra, desechos) Procesar más muestras con menos instrumentos. Page 4

5 por qué mucha gente no hace nada al respecto? La Revalidación es vista como algo costoso y tedioso, a pesar de los beneficios a largo plazo. Hay un sentimiento histórico no funciona tan fácilmente como decís en vuestros seminarios Hay quien piensa que se requiere un equipo especialido de UHPLC para hacer cromatografía rápida. Y que las opciones de mejora sin una posible degradación de la selectividad/resolución son limitadas. Page 5

6 Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden Usarse cumpliendo los Requirimientos USP L PACKING BRAND NAME MANUFACTURER Page 6 L L1 Octadecyl silane chemically bonded to porous silica or ceramic microparticles, 1.5 to 10 µm in diameter, or a monolithic rod AminoQuant AQUASIL C18 Ascentis C18 Ascentis Express C18 ASI C18 ASI Poroshell microc Atlantis dc18 Atlantis T3 Axxi-Chrom C18, ODS Bakerbond C18 BetaBasic 18 BetaMax Neutral BETASIL C18 Bio-C18 BioBasic 18 Bio-Sil ODS Bio-Sil ODS-10 Bondclone C18 BR-C18 Agilent Technologies Thermo Scientific Supelco Supelco Analytical Sciences Inc. Analytical Sciences Inc. Waters Corp. Waters Corp. Axxiom JT Baker Thermo Scientific Thermo Scientific Thermo Scientific Sepax Techonologies Thermo Scientific BIO-RAD Laboratories BIO-RAD Laboratories Phenomenex Sepax Techonologies De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 4/2009

7 Criterios de Ajuste de Métodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Métodos de Dimensiones de Columna Parámetro Especificaciones Máximas Comentarios/Ejemplos Longitud de Columna 70% 250mm 75mm 150mm 50mm 25% (FDA ORA-LAB 5.4.5*) 4.6 mm 3.0 mm (-35%) Diámetro Interno de USP 25% Columna ID Columna puede ajustarse si la 4.6 mm 2.1 mm (-54%) velocidad lineal es constante** 3.0 mm 2.1 mm (-30%) Flow Rate 50% Volumen de Inyección Tamaño de Partícula Reducir tanto como se necesite debe cumplir los límites de detección y precisión Reducir hasta el 50% (no se puede aumentar) *Cambiado en 2/24/09 Para la copia oficial y actual, ir a ** USP 30 Second Supplement Revisions, PF34(5), en proceso. Ver Stimuli article en Pharmacopeial Forum 2009; 35(6) Si cambia a una columna más corta, haga el cambio apropiado en el volumen de inyección Puede cambiar la longitud de columna y el tamaño de partícula para mantener la misma Rs 5um 3.5um (-30%) 5um 2.7um (-46%) Page 7

8 Pasos generales para desarrollar un método robusto en LC/LCMS Usar el tipo de cromatografía adecuado normalmente fase reversa (C18, polar embebida, etc ) o fases HILIC. Elegir las condiciones adecuadas para una separación isocrática o en gradiente. Ajustar el ph para una optima retención de los analítos Elegir la fase ligada adecuada para obtener una separación y resolución adecuada de los picos. 8

9 Consideraciones en la elección de la fase estacionaria de su columna. Diferentes interacciones para compuestos polares y no polares. Explotar otras interacciones con la fase ligada (e.g., pi-pi) El cambio de la fase móvil puede mejorar la selectividad/resolución y reducir el tiempo de análisis Cuando se usan columnas Poroshell 120 la comparación de las fases ligadas puede hacerse rápidamente! Con columnas de distintas fases ligadas y tecnologías de alta velocidad el traslado de métodos es muy fácil.

10 Una nueva herramienta para la selección de columnas en el desarrollo de métodos El Column and Sample Prep NAVIGATOR : Ayuda en la selección de columna y en la Preparación de Muestra! 10

11 Consideraciónes en el desarrollo de métodos en LCMS Selección de fase móvil A menudo se prefieren los gradientes debido a las diferencias en las características de retención. Elección del tampón Por ejemplo un tampón volátil para LCMS (Fórmico,acético, etc) Dimensiones de columna para una mayor sensibilidad y velocidad Elija columna estrechas para una mayor sensibilidad y más cortas para análisis rápidos. 11

12 Qué parámetros afectan a la resolución? Opciones positivas con bajo riesgo: Aumentar el flujo (en condiciones isocráticas) Disminuir el tiempo de gradiente, aumentando el flujo proporcionalmente Utilizar columnas con menor tamaño de partícula (permite utilizar columnas más cortas) Optimizar los parámetros del detector, reducir la dispersión del sistema. Opciones con mayor riesgo: Quimica de la Columna o de la fase móvil (cambios de selectividad) Temperatura de la columna (posibles cambios de selectividad) Ruerde siempre que cambios en la selectividad química son a menudo tan beneficiosos como perjudiciales. Pruebe primero las opciones positivas, luego explore las opciones con mayor riesgo. La disminución de la viscosidad de la fase móvil invariablemente mejora la eficaciá de la columna. Page 12

13 Cómo las dimensiones de la columna, el flujo y el tamaño de partícula influyen en la resolución y la velocidad Dimension Columna Tamaño partícula Eficiencia teórica,n Flujo (ml/min) Bar* Eficiencia estimada,n Veloc. neta Cambio neto en Resol. 4.6x250mm 5um 20, , x250mm 5um , x -29% 4.6x150mm 3.5um 17, , x -9% 4.6x150mm 3.5um 17, ,200 4x -15% 4.6x100mm 1.8um 22, , x -2% 4.6x100mm 1.8um 22, ,500 5x -2% * Presión en bares, fase móbil acetonitrilo/agua 60/40 v/v, 25 o C temperatura de operación Nota: Eficacia estimada para un pico con k o k* = 4, dispersión=20ul Page 13

14 LC Calculator Web Version LC Calculator Home Get the Mobile App Get the Desktop App How do I use this app? Dimensiones de la columna Porosidad Elección de solvente y porcentaje de composición Temperatura Flujo Preparation/LC-LC-MS-Columns/Pages/lccalcweb.aspx 14

15 Cálculos simples para la conversión de métodos Muchos usuarios quieren y necesitan trasladar métodos LC antíguos a métodos nuevos con columnas de tecnología avanzada. Muchos usuarios quieren convertir métodos LC-UV a métodos LC- MS predominantemente en modo ESI. Las Columnas con menores diametros son apropiadas para trabajar a flujos menores sin reducir la velocidad lineal ni la velocidad del análisis. Convertir estos métodos no es siempre tan fácil como parece. Los fabricantes de cromatografía pueden guiar a los usuarios a encontrar una solución eficaz bajo condiciones óptimas de operación. Page 15

16 Conversión del flujo Hay cuatro cálculos simples que definen la cantidad de muestra, las dimensiones de columna, el flujo y el tiempo. 1. Modificación del flujo, para columnas de diferentes diametros Flujo col. 1 Diam. Diam. column2 column1 2 Flujo col. 2 i.e. 2.1mm 1.0ml/min 0. 21ml/min 4.6mm 2 Page 16

17 Conversión de tiempo Hay cuatro cálculos simples que definen la cantidad de muestra, las dimensiones de columna, el flujo y el tiempo. 2. Segmento de gradiente o modificación del tiempo de análisis* Tiempo col.1 Longitud Longitud columna2 columna1 Tiempo col. 2 i.e. 25min. 150mm 250mm 15min. *asume un flujo proporcional para las columnas 1 y 2, según Equación 1 Page 17

18 Pendiente del gradiente vs. Tiempo y flujo Efectos k* ( K asterisco ) de la pendiente del gradiente el parámetro en gradiente equivalente al factor de capacidad k ( K prima ) en las separaciones isocráticas Aumentando k o k* generalmente aumenta la resolución. Esto puede hacerse disminuyendo la fuerza del solvente o disminuyebdo la pendiente del gradiente, respectivamente 3. Tiempo/ pendiente del gradiente % Pendiente del gradiente (%Final -%Inicial) # Volumenes de columna i.e. 8% (100% - 20%) 10 volumenes columna # volumenes de columna= (Flujo x Tiempo Gradiente) / volumen columna Volumen columna Zorbax = 3.14 x r 2 x L x 0.6 (r y L en cm) Page 18

19 Conversión del volumen de inyección Hay cuatro cálculos simples que definen la cantidad de muestra, las dimensiones de columna, el flujo y el tiempo. 4. Modificación del Volumen de Inyección Vol.iny Volumen columna2 Vol. Iny. col. 1 col. Volumen columna1 2 i.e. 20μl 0.4ml columna2 col mlcolumna1 μl col. 2 Volumen columna Zorbax = 3.14 x r 2 x L x 0.6 (r y L en cm) Page 19

20 Restricciones del sistema: dispersión de picos, limitaciones de flujo y presión La reducción del volumen de columna aumenta el efecto negativo del sistema en el ensanchamiento de picos.(recom. utilizar capilares 0.12mm y celda de pequeño volumen) El aumento del flujo puede afectar al rendimiento del desgasificador y la estabilidad de la presión comprobar especificaciones y precauciones con el fabricante. El aumento de flujo, junto con la disminución en el tamaño de partícula, producirá un aumento significativo de presión este efecto debe ser calculado antes de usar las condiciones de operación para asegurar unos valores aceptables Page 20

21 Consejo: Una mayor Temperatura puede mejorar la velocidad y la resolución La alta temperatura es un parametro a considerar en la optimización de métodos de Fast LC. Proporciona una transferencia de masa más rápida: Mejora la Eficiencia ( resolución) Disminuye el tiempo de analisis separaciones más rápidas sin pérdida en resolución. Disminuye la viscosidad de la fase móvil Baja la presión permite flujos mayores, separaciones más rápidas, mayor eficiencia Pueden cambiar la selectividad optimizar la resolución No es necesario llegar al límite-los valores medios tambien proporcionan beneficios

22 pr essur e Viscosidad de los solventes Presión del sistema con MeOH/Agua Columna de 4.6 x 50mm y partículas de 1.8um a 1 ml/min,30 o C Pr essur e cur ve per cent age of MeOH Use P de 4.6 x 50mm como punto de partida Multiplique P por L col2 / L col1 Si P es menor que la P Max del Instrumento puede usar esa longitud Porcentaje de MeOH (%) Presión (bar)

23 Pr essur e Viscosidad de los solventes Presión del sistema con ACN/Agua Columna de 4.6 x 50mm y partículas de 1.8um a 1 ml/min,30 o C Syst em pr essur e wi t h t he change of per cent age of ACN Porcentaje de ACN (%) Presión (bar) Per cent age of ACN Use P de 4.6 x 50mm como punto de partida Multiplique P por L col2 / L col1 Si P es menor que la P Max del Instrumento puede usar esa longitud

24 El Cambio en la Retención por el ph para compuestos Ionizables es clave en el desarrollo de métodos Los analitos no cargados tienen mejor retención en fase reversa (i.e. acidos a bajo ph y bases a alto ph) Los Silanoles de la silica ionizan a ph medio, incrementando la retención de los analitos básicos (i.e posibles interacciones de intercambio iónico) Elija el ph de la fase móvil para optimizar la retención y la selectividad durante el desarrollo de métodos. Las columnas Poroshell 120 EC-C18 pueden usarse en un amplio rango de ph.

25 Retention Time El Cambio en la retención con el ph para compuestos ionizables depende del tipo de compuesto Más retención para los analitos no cargados (i.e. acidos a bajo ph y bases a alto ph) Acetylsalicylic acid (pka 3.5) Pyridine (pka 5.2) Codeine (pka 8) Procainamide (pka 9.2) Amphetamine (pka 9.9) Caffeine (pka 14) ph 2.5 ph 6.5 ph 8 ph 11.5 Fase Movil: 45% MeOH, 55% 20 mm Tampón fosfato

26 Consejo: Method Translator facilita los cambios Truco: Deje que el Method Translator haga los cálculos Modo básico para una Fácil Transferencia de un Método Convencional a Fast LC Conversión del volumen de inyección Recomendación de parámetros del Detector Conversión de método gradiente e isocrático (auto-detección)

27 Agilent Method Translator Modo avanzado Información más detallada, pero aún fácil de usar Detailed Input Detailed Output Método Original Nuevo Método

28 Aumento de la eficacia de la separación con columnas UHPLC (superficial y totalmente porosas ) 28

29 Es fácil la transferencia de métodos? Cuales son los crietérios de ajuste de métodos de la USP y la FDA? Las columnas Poroshell 120 superficialmente porosas pueden usarse cumpliendo los requerimientos de la USP para el traslado de métodos sin necesidad de revalidar. Ejemplo de transferencia de un método USP a Poroshell 120 paso por paso.ajuste de parámetros para optimizar la separación Volumen de inyección, gradiente flujo, Velocidad de adquisición de datos Volumen extra columna 29

30 Separación inicial de 10 sulfamidas en 30 minutos Columna 4.6 x 250 mm, 5-um Agilent 1100 sin Mixer Capilares verdes 0.17mm G1315B, celda de flujo de 2 ul, 0.1s 30C Tiempo %B mau 100 Presión = 110 bar Par Crítico 1 ml/min 254 nm 5 ul inyección A: 0.1 % Ácido Fórmico en agua B: 0.1 % Ácido Fórmico en MeCN 80 Rs=1.21 Eclipse Plus C18, 4.6 x 250mm, 5um Vamos a convertir esta separación a Poroshell 120 EC-C18. El objetivo será acelerar la separación y no perder resolución del par críticio. min

31 Escalado del volumen de Inyección y del gradiente de una columna de 250 mm,5um a una Poroshell de 100 mm, 2.7um Agilent 1100 sin Mixer Capilares verdes 0.17mm G1315B, celda de flujo de 2 ul, 0.1s 30C Presión = 172 bar (100/250 x30 min) = 12 min (5 ul a 2 ul) Rs=1.23 Tiempo %B ml/min 254 nm 2 ul injection A: 0.1 % Ácido Fórmico en agua B: 0.1 % Ácido Fórmico en MeCN Poroshell120 EC-C x 100mm, 2.7um Separacion de 10 sulfamidas en una Poroshell 120 EC-C18, 4.6 x 100 mm, 2.7-um en 12 minutos usando un gradiente de ácido fórmico/acetonitrilo. min

32 Aumentamos el flujo de 1 ml/min a 1.5, y luego a 2 ml/min para optimizar por el menor tamaño de partícula 254 nm Time %B ml/min Rs=1.22 Poroshell 120 EC-C x 100mm, 2.7um Agilent 1100 sin Mixer Capilares verdes 0.17mm G1315B, celda de flujo de 2 ul, 0.1s 30C 2 ul inyección A: 0.1 % Ácido Fórmico en agua B: 0.1 % Ácido Fórmico en MeCN Time %B ml/min Rs=1.21 min 254 nm 2 ul inyección A: 0.1 % Ácido Fórmico en agua B 0.1 % Ácido Fórmico en MeCN Escalando del gradiente para un aumento de flujo de 1.0 ml/min a 1.5 ml/min y a 2.0 ml/min, resulta en una separación de 6 minutos en la Poroshell 120 EC-C18 column. La resolución no cambia. min

33 Gradiente rápidamente optimizado para la mejor selectividad en la Poroshell 120 EC-C Rs=1.23 mau mau Rs=1.22 min mau Rs=1.21 min min mau Rs= mau Rs= min min La resolución se mejora optimizando la separación del gradiente.

34 Mejora de la resolución y la velocidad con Poroshell Traslado de método de una columna Eclipse Plus C x 250 mm 5 um a una Poroshell 120 EC-C x 100 mm, 2.7um mau Tiempo %B Columna: Eclipse Plus C x 250mm, 5um Flujo: 1 ml/min 110 bar Fase Móvil: A: 0.1% Ácido Fórmico en Agua B: 0.1% Ácido Fórmico en ACN Tiempo %B Columna: 4.6 x 100mm Poroshell 120 EC-C18, 2.7um Flujo: 1.85 ml/min Sulfadiazina, Sulfatiazol Sulfapiridina Sulfamerazina, Sulfametazina, Sulfametazol, Sulfametoxipiridazina, Sulfacloropiridazina Sulfametoxazol, Sulfadimetoxina 0 mau bar Análisis más rápido(columna más corta, flujo más alto) Mayor sensibilidad(partícula más pequeña,pico más estrecho) Más optimizado (un análisis más rápido permite ajustar mejor) Ambos análisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar) No se requiere cambio en la preparación de muestra, frita de entrada de 2 micras en ambas columnas. min min Page 34

35 Comparación de 4.6 x 250 mm 5 um con Poroshell 120 EC-C x 100 mm, 2.7um Ver condiciones en diapositiva anterior mau 100 Rs= bar 20 mau bar Rs=1.9 min Mejor Resolución, linea base!! 0 5 min Page 35

36 Optimización de los parámetros del instrumento para el uso de columnas de pequeño volumen Los parámetros críticos del instrumento incluyen: Velocidad de adquisición de datos Isocrático y Gradiente Gradiente solo Tamaño de la celda de flujo Tubos capilares Volumen de mezcla (parte del volumen de retraso del gradiente) Volumen de retraso del gradiente (dwell volume)

37 Optimización de resultados con columnas sub-2um - Comparación de la velocidad de adquisición de datos Columna: ZORBAX Rapid Resolution HT SB-C x 30 mm, 1.8 µm Fase Mobil: 60% Metanol: 40 agua Flujo: 1mL/min Temperatura: RT Detección: UV 254 nm Muestra: QC Test 1. Uracilo 2. Fenol 3. 4-Cl-Nitrobenzeno 4. Tolueno Velocidad de adquisicion de datos = 2 seg Platos #3 Platos # min Velocidad de adquisicion de datos = 0.1 sec Platos #3 Platos # min

38 Contribución del Instrumento HPLC al rendimiento en Isocrático y en Gradiente Fase móvil { Dwell Volume Extra Column Volume (ECV) Detector ECV = volumen de muestra+ volumen tubos de conexión + volumen conectores+ volumen celda del detector Dwell Volume = volumen desde la formación del gradiente a la cabeza de la columna.

39 Maximizar la Eficacia usando columnas Agilent Poroshell 120 Evaluacion de N para la Poroshell mm 4.6 mm column Muestra:Thiourea, Acetophenone, Benzene, Toluene Column: Agilent Poroshell 120 SB-C mm 4.6 mm, 2.7 μm Fase Movil: Agua: ACN = 30:70 Flujo: 1.5 ml/min Volumen de Inyección: 1 μl Temperatura columna: 50 C Detector: DAD 254 nm/10, Ref 360/100 nm, 20 Hz, celda estandar Pressure: 200 bar 39

40 Maximizar la Eficacia usando columnas Agilent Poroshell platos en menos de 5 min usando 3 columnas en serie Muestra: Thiourea, Acetophenone, Benzene, Toluene Columna: Tres columnas Agilent Poroshell 120 SB- C18, 150 mm 4.6 mm, 2.7 μm Fase Movil: Water: ACN = 20:80 Flujo: 1, 1.5, 1.8 ml/min Volumen de inyección: 1 μl Temperatura columna: 60 C Detector: DAD 254 nm/10, Ref 360/100 nm, 20 Hz, celda estandard 40

41 Video para la transferencia de métodos con Poroshell 120 en la web de Agilent Columns/Analytical-HPLC-UHPLC/Poroshell-120/Pages/poroshell120video.aspx 41

42 UHPLC Porqué usar columnas diferentes? Los instrumentos UHPLC incluyen una variedad de opciones de alta presión además de las diseñadas para Alta productividad y Cromatografía Rápida. Estos instrumentos operan a presiones superiores a los 400 bar/6000 psi. El objetivo es tener columnas de pequeño tamaño de particula <2-3um para obtener una mejor eficacia, resolución y productividad en estos instrumentos. Esto nos da la flexibilidad de operar por encima de los 400 bar en muchas aplicaciones bien para obtener velocidad o bien para mejorar la resolución con columnas largas de 1.8um El nuevo Agilent 1290 Infinity puede operar hasta 1200 bar. Esto requiere columnas diseñadas para poder trabajar hasta los 1200 bar las nuevas columnas RRHD!

43 Separaciones por debajo de1 Minuto con Columnas RRHD 10 Compound Pharma Test Mix ZORBAX RRHD SB-C18, 2.1 x 100mm, 1.8 µm H 2 O (0.05% Acido Fórmico) / 2-98% Acetonitrilo T = 80 C Inj Vol = 0.5 µl WL = 210 nm DR = 80 Hz F P = 2 ml/min = 1085 bar 1.0min

44 Elige la Longitud de la columna según el Tiempo de Análisis y la Rs Fase Móvil: 40:60 agua:acetonitrilo, Flujo: 0.5 ml/min, Temp: ambiente, Columnas: RRHD SB-C18, 2.1 mm ID, Longitudes abajo Picos: 1: uracilo, 2 acetofenona, 3 propiofenona, 4 butirofenone, 5 valerofenona, 6 hexanofenona 50 mm 100 mm 150 mm 0 RRHD 1.8um 1200 bar Rs 3,2 : 5.64 N 6 : 10,700 Presión: 350 bar Solvente: 1,25mL min Rs 3,2 : 9.02 N 6 : 21,100 Presión : 566 bar Solvente: 1,75mL min Rs 3,2 : N 6 : 34,100 Presión :750 bar Solvente: 2,5mL min La columna RRHD de 150mm es una buena elección para alcanzar alta resolución con el 1290 Infinity LC. Page 44

45 Aumento de eficacia y Resolución con longitudes largas mm = 250 mm 1100 bar Fase Móvil:25:75 agua:acetonitrilo, Flujo: 0.5 ml/min, temperatura ambiente, Columnas ZORBAX RRHD SB-C18, 1.8um mau mm (P:582 bar) α 3,2 : 1.19 Rs 3,2 : 6.42 N 6 : 31,400 Pw 2 : min Pw 6 : min 0 mau Uracilo 2. Acetofenona 3. Propiofenona 4. Butirofenona 5. Valerofenona 6. Hexanofenona mm (P:1095 bar) min α 3,2 : 1.20 Rs 3,2 : 8.76 N 6 : 50,200 Pw 2 : min Pw 6 : min Alta Rs en 3.5 minutos, 250mm, 1.8um a 1100 bar La Resolución es buena con la columna de 150mm, pero con una columna más larga la resolución es mejor min Page 45

46 Dónde cae este ejemplo en el Rango del 1290 Infinity? (0,5ml/min bar) Esta app. cae en el Power Range Page 46

47 Guía de selección de columnas para el desarrollo de métodos rápidos 47

48 Nuevas tecnologías de columna para el desarrollo de métodos Columnas para análisis de alta resolución y alta velocidad Columnas Sub-2 µm totalmente porosas para operación a ultra altas presiones Columnas superficialmente porosas Sub-3 µm Considerations when developing methods on new column technologies Tamaños de particula < 2 μm, presiones típicas Tamaños de partícula < 3um, limite de presión 600 bares

49 Comparando Eficiencia y Presión con Diferentes Tipos de Columnas Tamaño de partícula/tipo 5µm Totalmente Porosa 3.5µm Totalmente Porosa 2.7µm Poroshell µm Totalmente Porosa Presión Eficiencia LC Compatibilidad 40 bar 5, bar 7, bar 12, bar 12,500 Todos los instrumentos hasta 400 bar Todos los instrumentos hasta 400 bar Todos LCs/UHPLCs (hasta 600 bar) Todos LCs/UHPLCs (hasta to 1200 bar) Columnas: 4.6 x 50mm, Fase Movil: 60% ACN:40% Agua Flujo: 2 ml/min

50 Columnas Superficialmente Porosas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC: Las Columnas Poroshell 120 tienen: 80-90% de eficicacia de las sub 2um A presiones un ~40-50% más bajas Con un tamaño de partícula de 2.7um Con una frita de entrada de 2um Con el doble de resolución de una columna de 3.5um Con un límite de presión de 600 bar 0.5um 1.7um La partícula tiene un núcleo sólido (1.7um) y una cubierta exterior porosa de 0.5um como zona de difusión 0.5um 50

51 Beneficios de la tecnologia de las columnas Poroshell 120 Permite aumentar la velocidad de separación (reducción del tiempo de análisis) Uso con cualquier instrumento (HPLC o UHPLC) Reducción de los costos de solventes y de desecho Poroshell 120 Escalabilidad Facilidad de transferencia dé métodos Mayor transferencia de masa debido a la menor difusión. Fases similares a las columnas ZORBAX totalmente porosas.

52 Mejoras en la transferencia de masas del analíto gracias a una menor Difusión Totalmente Porosa Superficialmente Porosa Particulas totalmente porosas Difusión a través de toda la partícula Poroshell 120 Difusión solo en la capa porosa Ecuación van Deemter h A B / Resultados: Menor término C Mayor eficiencia Y Mayores flujos con Mínimo impacto en la eficiencia C

53 Fases estacionarias de las columnas Poroshell 120 Poroshell 120 EC-C18 and C8 Robustas C18 y C8 desactivadas para las mejores formas de pico a ph 2-9 Poroshell 120 Stablebond C18 and C8 Química robusta para ph<2 Poroshell 120 Phenyl-Hexyl Misma selectividad que las ZORBAX Eclipse Plus Phenyl-Hexyl Excelente elección para interacciones pi-pi. Selectividad alternativa a EC-C18 o SB- C18 Selectividad similar a columnas fenil, difenil, u otras columnas fenil-hexil Poroshell 120 SB-Aq Fase de ligado propietario que es una excelente elección para analitos polares. Poroshell 120 Bonus-RP Su grupo polar embebido proporciona una selectividad única para compuestos polares Poroshell 120 EC-CN Química CN desactivada con caracter flexible para fase reversa y normal Poroshell 120 HILIC Sílica HILIC para uso en Cromatografía de Interacción Hidrofílica de moléculas polares.

54 Agilent tiene 3 tipos de columnas para UHPLC Hay 3 tipos de columnas UHPLC la elección depende de las necesidades Columnas RRHT columnas 1.8um para LC rápida hasta 600 bar Designadas para su uso con el Agilent 1200RRLC Compatible con algunos UHPLC s con límites de presión hasta 800 bar Columnas RRHD columnas1.8um hasta1200 bar Designadas para uso con el nuevo gilent 1290 Infinity LC Para trabajos hasta1200 bar Totalmente UHPLC compatible Poroshell 120 columns Límite the presión de 600 bar para uso con HPLC/UHPLC Excellent ajuste para LC s de 400 bar con resultados tipo UHPLC Page 54

55 Guías de Selección de Columnas Agilent UHPLC Análisis Rápido Alta Rs (N) 400 bar LC Compatible bar UHPLC Compatible Poroshell 120, 600 bar X only 2.7um Escalabilidad de Partícula 1.8, 3.5um etc. ID s 4.6, 3.0 & 2.1 mm Muestras sucias? frita 2um RRHT, 600 bar <50mm RRHD, 1200 bar X X (3.0 & 2.1) Page 55

56 Conclusiones Las conversiones de métodos son una oportunidad para aumentar la productividad en el laboratorio. Con los cálculos adecuados se obtienen mejoras en la resolución y en la selectividad. Para el uso de columnas más pequeñas con menores tamaños de partícula puede requerirse la optimización del sistema cromatográfico. La presión operativa puede verse incrementada asegúrese de que su sistema tiene la capacidad adecuada para operar a las presiones necesarias en el rango de flujos de los métodos optimizados. Las columnas Poroshell 120 superficialmente porosas están diseñadas para trabajar en los rangos de presiones de los equipos convencionales Page 56

57 Guía de Columna y Desarrollo de Métodos Solicite la Guía de Columnas y Desarrollo de Métodos: Una guía de 162 páginas con recomendaciones de columnas y pasos en el desarrollo de métodos. Número de Publicación EN 57

58 Soporte Técnico Agilent Teléfono de Atención al Cliente: