CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN. HPLC High Performance Liquid Chromatograpy

Transcripción

1 CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC High Performance Liquid Chromatograpy

2 Comparación HPLC y CG Volatilidad de la muestra HPLC ola volatilidad no es necesaria ola muestras deben ser solubles en la fase móvil CG ola muestra debe ser volátil obajo PM

3 Cromatografía líquida C.L.S. adsorción C:L:L: Reparto

4 Fase Normal Fase Estacionaria polar Fase Móvil no polar a lo polar incremento de la fuerza eluotrópica pigmentos separados

5 Fase Reversa FE no polar FM polar a lo no polar incremento de la fuerza eluotrópica

6 Hidrófilo Aminoácidos Iones inorgánicos Ácidos carboxílicos volátiles Sulfonamidas Cetonas de aldehídos Glifosatos Glicoles Colorantes alimentarios sintéticos PG, OG, DG fenoles Enzimas Aflatoxinas Alcoholes de azúcares Azúcares Polaridad Nitrosamina TMS derivado de azúcares Nitrilos Pesticidas organofósforos BHT (butilhidroxitolueno), BHA (butilhidroxianisol), THBO antioxidantes PCB Alcohol Aminas aromáticas PAHs Ácidos grasos Anabólicos Antibióticos Flavonoides Colorantes alim. naturales Vitaminas solubles en grasas Epóxidos Aceites esenciales Monómeros de polímero Triglicéridos Fosfolípidos Hidrófobo C2/C5 hidrocarburos Metiléster ácidos grasos Ésteres aromáticos Volátil Volatilidad No volátil 6

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8 HPLC Isocrático Solvente Bomba Inyector Columna Detector Registrador Electrometro

9 Solventes Pureza Grado HPLC Filtración Poro de 0.45 micras Nylon Teflón Desgacificación

10 Bombas Se requiere de una bomba que de una presión alta para forzar al líquido a pasar por la columna a una velocidad satisfactoria. Debe mantener el flujo constante durante períodos relativamente largos.

11 Las Bombas de Pistón dual

12 INJECTORES

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16 Columnas acero inoxidable (soportan presiones hasta 5000 psi) Diámetro de 1 a 6 mm Longitud de 10 a 30 cm El soportes para la fase líquida tierra de diatomeas, zipax o corasil

17 Columnas de HPLC Fase móvil desde la bomba Muestreador Precolumna Las columnas varían en los siguientes aspectos: Longitud Diámetro interno Material de la fase estacionaria Tamaño de partícula de la fase estacionaria Actúa sobre la muestra para atrapar partículas y componentes de muestras retenidos con fuerza. Al detector Columna analítica La columna analítica lleva a cabo la separación. 17

18 Columna - Acero inoxidable estándar Relleno de columna Capilar Frita de filtro de acero inoxidable Tamaño de poro de 2 um 18

19 Materiales de relleno de columnas - Sílice Esférico Irregular Soles de sílice Xerogeles Las partículas tienen un diámetro de 3 a 10 mm en las columnas estándar. 19

20 Materiales de relleno de columnas - Fases enlazadas Poros Cadena de carbono con forma de cepillo H 3 C Si CH 3 Fase enlazada monomérica O OH R 1 R 1 Si Si Si-OH + Cl-Si-R Si-O-Si-R + HCl O O O R2 R2 20

21 Materiales de relleno de columnas - Fases enlazadas extensamente utilizadas HPLC de fase inversa C18 C8 C4 C1 Fenilo Las columnas de HPLC más utilizadas Separaciones de proteínas Dipolo débil - dipolo inducido Interacciones con analitos polares HPLC de fase normal o inversa CN NH 2 Polaridad intermedia HPLC de fase normal Diol Separaciones de compuestos con polaridades muy diferentes Intercambio iónico CH 3-0-Si- R CH 3 DEAE (dietilaminoetanol) QAE (aminoetilo cuaternario) Carboximetilo Exclusión de tamaño Glicerilpropilo 21

22 Materiales de relleno de columnas Rendimiento mejorado de desoxinucleósidos utilizando fase enlazada óptima LC: HP1090 Columnas: 4,6 x 50 mm, 3,5 µm Flujo: 1,0 ml / min. A: 0,1% TFA B: 90% MeOH: 10% H 2 O (0,1% TFA) Temp.: 30 C Detec.: 254 nm mau mau G C C T A G T 2 min A Zorbax SB-C18 92% A : 8% B 6 min Zorbax SB-CN 97,5% A : 2,5% B DAD1 A, Sig=254,16 Ref= DAD1 A, Sig=254,16 Ref= min 22

23 Materiales de relleno de columnas - Soportes de polímeros Estireno Divinil benceno Estireno-divinilbenceno CH = CH 2 CH = CH 2 - CH 2 - CH - CH- 2 - CH - CHC 2 - CH - CH CH = CH 2 - CH 2 - CH - CH- 2 - CH - CHC 2 - CH - CH Admiten: l Fase normal e inversa l Intercambiadores iónicos l Cromatografía por exclusión de tamaño 23

24 Tamaño de partícula - Efecto en la eficacia N Teórico 5 -µm 3 -µm 10 -µm Velocidad de flujo Número de platos/metro/10 3 Velocidad de flujo de la fase móvil, ml/min Columnas Zorbax SB-C8; d.i. de columna, 4,6 mm; ciprofloxacina; 22 C Fase móvil, 20% ACN/80% acuosa, 0,1% TFA 24

25 Número aproximado de platos (N) y volumen vacío (Vm) para columnas de 5 mm y 3,5 mm Si se reducen simultáneamente la longitud de la columna (N ) y el tamaño de partícula (N ), se podrá: Mantener la resolución Reducir el tiempo de análisis Reducir el uso de disolventes Tamaño de la Número de platos Volumen vacío Tamaño de partícula columna (N) (V m ) 4,6 x 250 mm 5- m m ,5 ml 4,6 x 150 mm 5- m m ,5 ml 4,6 x 150 mm 3.5- m m Resolución rápida ,5 ml 4,6 x 75 mm 3.5- m m Resolución rápida ,75 ml 4,6 x 50 mm 3.5- m m Resolución rápida ,5 ml 4,6 x 30 mm 3.5- m m Resolución rápida ,3 ml 4,6 x 15 mm 3.5- m m Resolución rápida ,15 ml 25

26 Aumentar la velocidad de análisis mientras se mantiene la resolución 5 mm 3,5 mm 5 mm 3,5 mm Dimensiones 250 x 4,6 mm 150 x 4,6mm 150 x 4,6 mm 75 x 4,6 mm Tiempo de análisis (min) Residuo de disolvente (ml) 40% 30 min 18 min 18 min 9 min Reducción 40% 30 ml 18 ml 18 ml 9 ml Reducción 50% Reducción 50% Reducción N Sin modificar 9% de diferencia 26

27 Presión mau bar 0 Conseguir todo el potencial con mayor velocidad de flujo Rs 2,1 = 2,2 Rs 7,6 = 2,2 Velocidad de flujo 2 ml/min mau bar 0 3 ml/min mau bar 0 0 Rs 2,1 = 2,1 Rs 7,6 = 2,2 30 seg 0,1 0,2 0,3 0,4 0, ,9 min 4 ml/min Zorbax SB-C18, 3,5 µm, 4,6 x 30 mm 27

28 Columnas con diámetro interno pequeño y muy pequeño 4,6 mm d = 10 dmm p Convencional 1,00 ml/min 4,6 mm d = 5 dmm p Diámetro interno muy pequeño 2,1 mm o 1,0 mm Ventajas: d = 5 dmm p 100 mm Consumo reducido de disolvente. 200 mm Idóneas para análisis de trazas si la cantidad de muestra es limitado. Fácil conversión de velocidad de flujo para cambiar el método de columna analítica a columna de diámetro muy pequeño. Inconvenientes: 0,01 ml/min La instrumentación debe tener un volumen externo a la columna muy bajo. Las fritas se deben cambiar con más frecuencia. 28

29 Velocidades de flujo típicas d.i. de columna (partículas de 5 Flujo ml/min mm ) 4, ,0 0,4-0,8 2,1 0,2 0,4 1,0 0,05 0,09 29

30 Adsorbance Absorbancia SB-C18 4,6 x 15 mm Longitud de columna - Adaptar la longitud a la resolución deseada los 7 componentes se descomponen en menos de 1 min DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,4 4,6 x 30 mm Condiciones: LC: Hewlett-Packard HP1100 Columnas: Zorbax SB-C18, 3,5 µm Fase móvil: 1 mm octano ácido sulfónico, Na sal, ph 2,5: ACN (80:20) DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,4 UV: 275 nm; flujo: 2,0 ml / min.; 70 C Vol. de inyección: 1 µl 4,6 x 50 mm Muestra: 1. Acetoaminofeno (4-acetoamidofenol) 2. Cafeína 3. 2-Ac2-Acetoamidofenol 4. Acetanilida 5. Aspirina (ácido acetilsalicílico) DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,4 6. Ácido salicílico 7. Fenacetina (acetofenetidina) 4,6 x 75 mm DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,4 4,6 x 150 mm DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360, min 30