Fundamentos de la UHPLC.

Transcripción

1 UHPLC MasterClass Junio 2013 Fundamentos de la UHPLC Infinity 1260 Infinity 1290 Infinity Isidre Masana Agilent Technologies Especialista Productos UHPLC/MS

2 Agenda 1. Fundamentos de la UHPLC: Historia e Introducción Fundamentos Ecuación de Van Deemter Aumento de la capacidad de separación en gradientes al aumentar el flujo de trabajo 2. Conclusiones. Página: 2

4 Pequeña historia de la UHPLC 198X Ya existían en el mercado columnas de 1.5 µm (x30mm long.) 2003 Agilent 1100 Binario Columnas 1.8µm RRHT UFLC 2004 Waters Acquity Columnas 1.7µm BEH UPLC 2006 Agilent 1200 RRLC 2ª generación 1.8µm UHPLC Thermo Accela Columnas 1.9µm Jasco Xtreme-LC 2007 Shimadzu UFLCxr Hitachi LaChrom Ultra Scient. Syst. Ultra HP 2008 Dionex RSLC Knauer Platin Blue 2009 PE Flexar Agilent 1290 Binario 2012 Agilent 1290 Cuaternario 10 New UHPLC Systems in 5 Years All different. 10 nuevos sistemas UHPLC en 5 años -Todos con características diferentes Página: 4

5 Fundamentos UHPLC 1. Ecuación de Van Deemter: Capacidad de poder trabajar a flujos elevados SIN perder eficacia, con columnas: De pequeño tamaño de partícula totalmente porosas (TP <2µm) Fino espesor de fase estacionaria; columnas núcleo sólido superficialmente porosas (SP 2.7µm). 2. Ecuación de la Capacidad de Separación en Gradientes: La capacidad de separación de picos trabajando con gradientes de concentración es directamente proporcional al flujo de trabajo y al tiempo de gradiente subir el flujo permitirá mejorar la separación con gradientes. Página: 5

6 Columnas UHPLC versus HPLC UHPLC: Columnas que permiten trabajar a flujos elevados SIN perder eficacia: Rellenos totalmente porosos de pequeño tamaño de partícula (<2µm). Rellenos superficialmente porosos (fino espesor de fase estacionaria 0.5µm) con núcleo sólido ( 1.7µm). Tipo Poroshell-120 Los cromatógrafos de 400 bars se pueden adaptar para trabajar con columnas de UHPLC tipo Poroshell-120 (hasta 10cm long.) y totalmente porosas de 1.8µm (hasta 5cm long.) con acetonitrilo/agua. HPLC: Columnas tradicionales de 3.5 y 5µm de tamaño de partícula. Página: 6

8 Optimización del Flujo de Fase Móvil. Ecuación Van Deemter: Inverso Eficacia vs Flujo 1/N Plate Height H: HEPT H min H = A + B + C u u H Sum Curve: Van Deemter C Diffusion Path Deviations into pores of particle Porous Particles Static Mobile Phase Resistance to Mass Transfer * Página 8 B Eddy Diffusion * Longitudinal diffusion Linear Velocity u u opt * Peak Broadening due to the A term reduces proportionally with Dp * Peak Broadening due to the B: at low velocity, time in mobile phase is longer, diffusion decreases N, increasing H. More concentrated band of sample diffuses more rapidly than a less concentrated band under the same conditions * Peak Broadening due to the C term: 1.-at higher velocity, solutes undergo fewer transitions, N is smaller, H is larger 2.- reduces proportionally with D 2 p A

9 Efecto en la Eficacia del Tamaño de Partícula. HPLC vs UHPLC: Gráfico Van Deemter / Diámetro Columna & Espesor Film (GC) + EFICACIA EFICACIA A FLUJOS ÓPTIMOS Partícula H_min 5 μm 9,1 μm 3,5 μm 5,8 μm 1,8 μm 3,7 μm 1/ 2.5 N(1.8µm) = 2.5 x N(5µm) 1.6 x Rs(5µm) HPLC Ultra Fast LC GC: Diám. col. cap. Espesor film f.estac. N Columnas: ZORBAX Eclipse XDB-C18 Dimensiones: 4,6 x 50 mm (30 mm, 1,8 m) Eluyente: 85:15 ACN: Agua Velocidades de flujo: 0,05 5,0 ml/min Temp: 20 C Muestra: 1,0 L octanofenona en eluyente S.T.M.: Sub Two Microns HPLC:EFICACIA A FLUJOS ALTOS: Particulas1,8 μm a 5ml/min* dan más eficacia N(1.8µm) = 2.5 x N(3.5µm) = 4 x N(5µm) * 5ml/min con columnas 4.6mm - 1ml/min con columnas de 2.1mm D.I. Página 9

10 Ejemplo de Mejora de Resolución HPLC vs UHPLC con Columnas de 150mm x 1.8µm Ejemplo con muestra compleja: hasta un 60% de Mejora en la Resolución HPLC UHPLC Ejemplo de un cliente Método Impurezas Isocr. Zoom zona critica rango 7min 4 Impurezas 2 No Separadas a línea de base 7 Impurezas 6 No Separadas a línea de base 7 Impurezas Las 7 Separadas a línea de base 4.6 x 150, 5um 93 bar N = 7259 R S = 1.15 S/N = x 150, 3.5um 165 bar N = R S = 1.37 S/N = x 150, 1.8um 490 bar N = R S = 1.80 (+ 57%) S/N = 44 Página 10

11 Ejemplo de Mejora de Velocidad HPLC vs UHPLC Agilent 1200-RRLC (600bars) Hasta 20x más rápido que un HPLC. Manteniendo la resolución 4.6 x 150mm, 5µm 1.20ml/min, 40 C Grad.: 35-95% en 10.8 min Analysis Time = 11min min HPLC, 40 C PW = 3.4sec 2.1mm x 50mm 1.8µm 1.00ml/min, 40 C Grad.: 35-95% en 0.9 min Analysis Time= 1.1min min UHPLC/RRLC, 40 C 10x faster PW = 0.5 sec 2.1mm x 50mm 1.8µm 2.40ml/min, 95 C Grad.: 35-95% en 0.38 min Analysis Time: 0.4min UHPLC/RRLC, 95 C 27x faster PW = 197msec min mm > 50mm: 1.2ml/min on 4.6 > 2.4ml/min on 2.1: 3x 10x 3 x 10 = 30x Página 11

12 H (µm) Efecto de la Temperatura en Gráfico de Van Deemter Al aumentar la temperatura el óptimo se desplaza a flujos mayores H = f (u) butilparaben Tamaño partícula: 5 µm ºC 60ºC 90ºC ºC u o, opt u (mm/s) 25 C, 45%ACN 60 C, 40%ACN 90 C, 35%ACN 120 C, 28%ACN HTLC: HPLC a Alta Temperatura permite trabajar a mayores flujos sin pérdida de eficiencia y con mejor transferencia de masa (curva más plana a flujos altos) Página 12

13 Agenda 1. Fundamentos de la UHPLC: Historia e Introducción Fundamentos Ecuación de Van Deemter. Aumento de la capacidad de separación en gradientes al aumentar el flujo de trabajo. 2. Conclusiones. Página: 13

14 Porqué es Importante en Gradiente poder trabajar a FLUJOS Elevados en HPLC y UHPLC? La Capacidad de Separación de picos con Gradientes de concentración, es DIRECTAMENTE proporcional al FLUJO y al tiempo del gradiente: x2 flujo gradiente x2 nº de picos que puedo separar*. x3 flujo gradiente x3 nº de picos que puedo separar*... Flujos elevados permiten maximizar el poder de separación en gradiente por unidad de tiempo: P. Petersson et al., J.Sep.Sci, 2008,31, K α F x T g D. Guillarme et al., Journal of Chromatography A, 1216 (2009) * El nº de picos que se pueden separar aumentará algo menos con columnas de 5um (por la ligera perdida de eficacia al subir el flujo), pero aún así compensa la pérdida de eficacia. Página: 14

15 HPLC con GRADIENTES: NO es Imprescindible Cambiar de Columna para Reducir Tiempos SIN perder Resolución Incluso con tamaños de partícula de 5 y 3.5µm F = 2.0 ml/min T g = 3 min min Columna: ZORBAX Eclipse XDB-C8 4.6x50, 3.5µm Gradiente 45 90% B en 3 y 2 min Fase Móvil: A:25mM Na 2 HPO 4, ph 3 B: Metanol Flujo: 2 y 3 ml/min Temperatura: 35 C Muestra: Fármacos Cardiacos:1. Diltiazam 2. Dipyradamole 3. Nifedipina 4. Lidoflazina 5. Flunarizina F = 3.0 ml/min T g = 2 min min Time (min) K = (87 x F x T g ) / (Δ % x V 0 x S) Time (min) Si mantenemos Tg=3 ( y F=3) obtendremos: +Resolución y un tiempo análisis < 3min Sin cambiar de columna, ni de tiempo de gradiente, SUBIR el FLUJO, permitirá mejorar la resolución/capacidad de separación. El aumento de capacidad de separación al subir el flujo, compensa la pérdida de eficacia de las columnas de 3.5 y 5 µm. Página: 15

16 La Ventaja de Subir el Flujo Trabajando con Gradientes Incluso en HPLC (columnas 3.5 y 5µm) + EFICACIA - Página: EFICACIA A FLUJOS ÓPTIMOS Partícula H_min 5 μm 9,1 μm 3,5 μm 5,8 μm 1,8 μm 3,7 μm 1/ 2.5 N(1.8µm) = 2.5 x N(5µm) 1.6 x Rs(5µm) HPLC Ultra Fast LC K = (87 x F x T g ) / ( Δ % x V 0 x S) Columnas: ZORBAX Eclipse XDB-C18 Dimensiones: 4,6 x 50 mm (30 mm, 1,8 m) Eluyente: 85:15 ACN: Agua Velocidades de flujo: 0,05 5,0 ml/min Temp: 20 C Muestra: 1,0 L octanofenona en eluyente ó Poroshell 120 Las columnas de 1.8µm NO conviene que trabajen a flujos bajos; empiezan a perder eficacia por debajo de 0.8mL/min (en columnas 4.6mm d.i //0.16 ml/min con 2.1mm d.i..) El aumento de capacidad de separación al subir el flujo, compensa la pérdida de eficacia de las columnas de 3.5 y 5 µm.: 5µm ml/min: Eficacia/2.4 pero Capacidad Separación x7 3.5µm ml/min: Eficacia/2 pero Capacidad Separación x6 * 5ml/min con columnas 4.6mm - 1ml/min con columnas de 2.1mm D.I.

17 Influencia del Flujo en Gradiente con Columnas 5 µm Comparación GRADIENTE 10 min a ml/min con Columna 5µm 150x4.6mm 1mL/min FxTg= 10 8min 3mL/min FxTg= min Al subir flujo se reduce el tiempo y el ancho de los picos 5mL/min FxTg= min 1290 Infinity Cuaternario Columna: 5µm 4.6x150mm Eclipse XDB-C8 Gradiente: Flujo: Inyección: H20/ACN 50/50-0/100 en 10 min 1, 3 y 5mL/min (pruebas respetando Pmáx columna: 400bars) 40ºC. 2 µl muestra (1500ppm dimetilftalato y dietilftalato, 100 ppm bifenilo, y 300ppm o- terfenilo en metanol) Página: 17

18 Influencia del Flujo en Gradiente con Columnas 5 µm Comparación en ESCALA TIEMPO NORMALIZADA GRADIENTE 10 min a ml/min con Columna 5µm 150x4.6mm Peak width: Peak width: mL/min FxTg= 10 8min Peak width: Peak width: Peak width: mL/min FxTg= min Peak width: Flujo ml/ min Capacidad Separación Nº picos (ref.1º) Capacidad Separación Nº picos (ref.3º) Peak width: Al subir flujo en gradiente se reduce el tiempo y el ancho de los picos y en especial de los del principio mejora la capacidad de separación de picos Peak width: mL/min FxTg= min Peak width: Nº de picos que se pueden separar con resolución hasta línea de base en función del ancho en línea de base del 1er (zona inicial) y 3er pico (zona central) del cromatograma a distintos flujos con la columna de 5µm totalmente porosa Página: 18 Al subir flujo aumenta el nº de picos que se pueden separar -INCLUSO con una columna de 5µm- y además se reduce el tiempo e análisis

19 HPLC ISOCRÁTICO: Pérdida de Eficacia con 5 µm a Flujos Elevados Comparación Isocrático a ml/min con Columna 5µm 150x4.6mm 1mL/min 3mL/min Entre 1 y 3ml/min apenas se aprecia pérdida de resolución mau DAD1 A, Sig=240,80 Ref=360,100 of AIAFOR~1\1AA-0401.AIA\SIGNAL01.CDF (AIA imported) Flujo: 1 ml/min. ACN/H2O 70/30 N= mL/min Comparación Normalizada N= min 0 mau mau DAD1 A, Sig=240,80 Ref=360,100 of AIAFOR~1\1AA-3601.AIA\SIGNAL01.CDF (AIA imported) Flujo: 3 ml/min. ACN/H2O 70/30 N= N= DAD1 A, Sig=240,80 Ref=360,100 of AIAFOR~1\1AA-0501.AIA\SIGNAL01.CDF (AIA imported) Flujo: 5 ml/min. ACN/H2O 70/30 N= N= Isocrático: ACN/H2O 70/ min En ISOCRÁTICO Con 5µm hay una pérdida de eficacia al pasar de 1 a 3-5 ml/min, pero mantiene una buena resolución. 5ml/min con columna 4.6mm d.i.: N(1.8µm) = 2.5 x N(3.5µm) = 4 x N(5µm) min Inyección: 5 µl muestra (isocrática:1500ppm dimetilftalato y dietilftalato, 100 ppm bifenilo, y 300ppm o-terfenilo en metanol Detección: DAD 240/80 nm ref:360/100nm, slit 8nm y frecuencia de adquisición a 0.01 y 0.05min Celda 6mm y 5µl min Página 19

21 Conclusiones: UHPLC versus HPLC UHPLC permite MAXIMIZAR: Reducción de Tiempos de Análisis SIN perder Resolución. Aumentar la Resolución SIN incrementar tiempo de Análisis. HPLC (400 bars) -incluso sin cambiar de columna- permite: Simplemente SUBIENDO el FLUJO de trabajo* Reducir Tiempos y Aumentar la Resolución. * Trabajando con gradientes de concentración Página: 21

22 Serie 1200 Infinity: la Máxima Flexibilidad para trabajar en HPLC y UHPLC, en Todo Tipo Aplicaciones. Hasta 5mL/min* para máxima eficacia y mínimo tiempo de análisis incluso con las tradicionales y robustas columnas de 4.6mm d.i 1220 Infinity 1260 Infinity 1290 Infinity *hasta 10mL/min con bombas cuaternarias Página: 22

23 Agilent 1290 Infinity LC Muchas Gracias por su Atención Estamos a su disposición en tel.: customercare_spain@agilent.com isidre_masana@agilent.com