Page 1 SEPARACIONES RÁPIDAS Y DE ALTA EFICACIA EN EQUIPOS HPLC CONVENCIONALES

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1 Page 1 SEPARACIONES RÁPIDAS Y DE ALTA EFICACIA EN EQUIPOS HPLC CONVENCIONALES

2 Poroshell 12 Una nueva aproximación a la Alta Resolución y la Alta Velocidad en LC Poroshell 12 es una columna de alta eficacia y alta resolución para mejorar la productividad en un HPLC o UHPLC. Para separaciones de alta resolución en equipos 12, 11 y otros HPLCs (Presión < 4 bar). Columnas de 4.6 y 3. mm ID de gran volumen para cualquier HPLC Columnas de 2.1 mm ID adecuadas para LC/MS y sistemas optimizados para bajos volumenes de columna. Para separaciones de alta presión en equipos 12 RRLC, 129 Infinity u otros UHPLC con Presión > 4 bar La columnas Poroshell 12 largas proporcionan una elevada eficacia (un columna o dos columnas en serie). Boost your LC Productivity Seminars 21 Page 2

3 Columnas Poroshell 12 para HPLC y UHPLC: Las Columnas Poroshell 12 tienen: 8-9% de eficicacia de las sub 2um A presiones un ~4-5% más bajas Con un tamaño de partícula de 2.7um Con una frita de entrada de 2um Con el doble de resolución de una columna de 3.5um Con un límite de presión de 6 bar La partícula tiene un núcleo sólido (1.7um) y una cubierta exterior porosa de.5um como zona de difusión Page 3

4 Poroshell 12 proporciona Eficacia Suficiente! Poroshell 12 EC-C18, 3. x 1 mm, 2.7 um 6 N = 2553, Presión = 182 bar Flujo:.582 ml/min Acetonitrilo/Agua (6:4) Volumen de Inyección: 4 µl TCC: 26 o C DAD: Sig=254,4nm Ref=36,1nm >9% de la Eficacia de una 1.8um Eclipse Plus C18, 3. x 1 mm, 1.8 um Muestra: Muestra de test RRLC (PN ) inoculada con 5 µl 2 mg/ml Tiourea en agua/acetonitrilo (65:35) 6 4 N = 27295, Presión = 386 bar min Page 4

5 Alta Eficacia en Poroshell 12 EC-C18 a baja presión Test QC Medidad de la Eficacia con compuestos neutros 25,75 P= 254 bar 25, min Columna: Poroshell 12 EC-C18, 4.6 x 1mm PN Instrumento: 12 SL Celda de Flujo de 2ul Flujo: 2. ml/min Muestra: 2ul inyección de 3B Fase Móvil: 6:4 MeCN:Water Page 5

6 Elija Poroshell 12 para HPLC de Alta Eficacia Columnas: 3. x 1mm, Fase Móvil: 65% A:.2% Ácido Fórmico: 35% B: Metanol Isocratico, Flujo.5 ml/min 1 µl inyección 26 C Sig = 22, 4 nm, Ref = Off Muestra: 1. Sacarina 2. Cafeina 3. Ácido P-hidroxibenzoico 4. Aspartamo 5. Ácido Dehidroacético 6. Ácido Benzoico Poroshell 12 EC-C18, 3. x 1mm, 2.7 µm; N = 21,567, P = 3 bar Casi 2X la eficicacia de 3.5um Presión HPLC (< 4 bar) min RRHT Eclipse Plus C18 3. x 1mm, 1.8 µm; N = 25753, P = 456 bar Rapid Resolution Eclipse Plus C18, 3. x 1mm 3.5 µm; N = 11651, P = 153 bar min min Page 6

7 Poroshell 12 EC-C18 para Separaciones rápidas en UHPLC Columna: Poroshell 12 EC-C18 3. x 1mm, 2.7um Fase Móvil: 65% A:.2% Ácido Fórmico: 35% B: Metanol Isocrático, Varios Flujos 1 µl inyección 26 o C Señal = 22, 4 nm, Ref = Off Muestra: 1. Sacarina 2. Cafeina 3. Ácido P- hidroxibenzoico 4. Aspartamo 5. Ácido Dehidroacético 6. Ácido Benzoico Flujo =.5 ml/min, P = 3 bar, N AB = Flujo =.75 ml/min, P = 433 bar min Flujo = 1. ml/min, P = 559 bar Pueden usarse Solventes más viscosos como el metanol a presiones HPLC o UHPLC. Page 7

8 Maximizar la Eficacia usando columnas Agilent Poroshell 12 Evaluacion de N para la Poroshell mm 4.6 mm column Muestra:Thiourea, Acetophenone, Benzene, Toluene Column: Agilent Poroshell 12 SB-C18 15 mm 4.6 mm, 2.7 μm Fase Movil: Agua: ACN = 3:7 Flujo: 1.5 ml/min Volumen de Inyección: 1 μl Temperatura columna: 5 C Detector: DAD 254 nm/1, Ref 36/1 nm, 2 Hz, celda estandar Pressure: 2 bar 8

9 Maximizar la Eficacia usando columnas Agilent Poroshell platos en menos de 5 min usando 3 columnas en serie Muestra: Thiourea, Acetophenone, Benzene, Toluene Columna: Tres columnas Agilent Poroshell 12 SB- C18, 15 mm 4.6 mm, 2.7 μm Fase Movil: Water: ACN = 2:8 Flujo: 1, 1.5, 1.8 ml/min Volumen de inyección: 1 μl Temperatura columna: 6 C Detector: DAD 254 nm/1, Ref 36/1 nm, 2 Hz, celda estandard 9

10 En qué tipos de instrumentos puede usar Columnas Poroshell 12? HPLC s y UHPLC s Consideraciones en UHPLC Las columnas Poroshell 12 tienen un límite de presión de 6 bar Los UHPLC están ajustados para columnas de bajo volumen, por lo tanto las Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC Consideraciones en HPLC Las Columnas Poroshell 12 trabajan bien por debajo de 4 bar Minimize los volumenes extra columna para las columnas 2.1 y 3.mm ID siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (1.8um, 6 bar) Use en el detector velocidades adecuadas de adquisición para picos estrechos, de alta eficacia. Page 1

11 Pressure Efficiency (N) Con una frita de 2 um Poroshell 12 no se bloquea Muestras Complejas- Plasma Columna: Poroshell 12 EC-C18, 3. x 5mm, 2.7um LC: Agilent 12 RRLC (SL) Muestra: Plasma Precipitado: 2 partes Plasma: 7 Partes 2/8 Agua-MeCN w/.1 % Ácido Fórmico con 1 Parte de Diflusinal en 5/5 Agua-MeCN 1 ug/ml (Concentracion Final Diflusinal 1 ug/ml) Agitado y dejado reposar 1 minutos No Centrifugado/ No Filtrado Volumen de Inyección: 1ul Diflusinal in Plasma Injections Solvente A: Agua w/.1 % TFA Solvente B: MeCN w/.8 % TFA Flujo 1 ml/min 1 ul inyección Tiempo % B End Press Plates 'Diflunisal' es un anti-inflamatorio no esteroidal análogo a la aspirina. desarrollado por Merck Sharp & Dohme. Page 11

12 Historia real de un cliente Sueco Cromatograma hecho con una Poroshell 3x2,1mm EC-C18. Estamos inyectando muestras de plasma sucias, agitadas y centrifugadas y luego inyectando directamente la muestra en columna. La columna lleva inyecciones y practicamente no ha perdido retención ni resolución para ninguno de los analítos. Y todavia funciona bien! 12

13 Historia real de un cliente Sueco The difference in peak height between the two first peaks on each chromatogram is because we now use a lower concentration in the test mix. 13

14 Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden Usarse cumpliendo los Requirimientos USP L PACKING BRAND NAME MANUFACTURER Page 14 L L1 Octadecyl silane chemically bonded to porous silica or ceramic microparticles, 1.5 to 1 µm in diameter, or a monolithic rod AminoQuant AQUASIL C18 Ascentis C18 Ascentis Express C18 ASI C18 ASI microc18 Atlantis dc18 Atlantis T3 Axxi-Chrom C18, ODS Bakerbond C18 BetaBasic 18 BetaMax Neutral BETASIL C18 Bio-C18 BioBasic 18 Bio-Sil ODS Bio-Sil ODS-1 Bondclone C18 BR-C18 Agilent Technologies Thermo Scientific Supelco Supelco Analytical Sciences Inc. Analytical Sciences Inc. Waters Corp. Waters Corp. Axxiom JT Baker Thermo Scientific Thermo Scientific Thermo Scientific Sepax Techonologies Thermo Scientific BIO-RAD Laboratories BIO-RAD Laboratories Phenomenex Sepax Techonologies De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 4/29

15 Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden Usarse cumpliendo los Requirimientos USP L PACKING BRAND NAME MANUFACTURER Page 15 L L1 Octadecyl silane chemically bonded to porous silica or ceramic microparticles, 1.5 to 1 µm in diameter, or a monolithic rod AminoQuant AQUASIL C18 Ascentis C18 Ascentis Express C18 ASI C18 ASI microc18 Atlantis dc18 Atlantis T3 Axxi-Chrom C18, ODS Bakerbond C18 BetaBasic 18 BetaMax Neutral BETASIL C18 Bio-C18 BioBasic 18 Bio-Sil ODS Bio-Sil ODS-1 Bondclone C18 BR-C18 Agilent Technologies Thermo Scientific Supelco Supelco Analytical Sciences Inc. Analytical Sciences Inc. Waters Corp. Waters Corp. Axxiom JT Baker Thermo Scientific Thermo Scientific Thermo Scientific Sepax Techonologies Thermo Scientific BIO-RAD Laboratories BIO-RAD Laboratories Phenomenex Sepax Techonologies De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 4/29

16 Criterios de Ajuste de Métodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Métodos de Dimensiones de Columna Parámetro Especificaciones Máximas Comentarios/Ejemplos Longitud de Columna ± 7% 25mm 75mm 15mm 5mm ±25% (FDA ORA-LAB 5.4.5*) 4.6 mm 3. mm (-35%) Diámetro Interno de USP ± 25% Columna ID Columna puede ajustarse si la 4.6 mm 2.1 mm (-54%) velocidad lineal es constante** 3. mm 2.1 mm (-3%) Flow Rate ±5% Volumen de Inyección Tamaño de Partícula Reducir tanto como se necesite debe cumplir los límites de detección y precisión Reducir hasta el 5% (no se puede aumentar) *Cambiado en 2/24/9 Para la copia oficial y actual, ir a ** USP 3 Second Supplement Revisions, PF34(5), en proceso. Ver Stimuli article en Pharmacopeial Forum 29; 35(6) Si cambia a una columna más corta, haga el cambio apropiado en el volumen de inyección Puede cambiar la longitud de columna y el tamaño de partícula para mantener la misma Rs 5um 3.5um (-3%) 5um 2.7um (-46%) Page 16

17 Comparación de 4.6 x 25 mm 5 um con Poroshell 12 EC-C x 1 mm, 2.7um Tiempo %B Columna: Eclipse Plus C x 25mm, 5um Flujo: 1 ml/min 11 bar Fase Móvil: A:.1% Ácido Fórmico en Agua B:.1% Ácido Fórmico en ACN Tiempo %B Columna: 4.6 x 1mm Poroshell 12 EC-C18, 2.7um Flujo: 1.85 ml/min Sulfadiazina, Sulfatiazol Sulfapiridina Sulfamerazina, Sulfametazina, Sulfametazol, Sulfametoxipiridazina, Sulfacloropiridazina Sulfametoxazol, Sulfadimetoxina bar Análisis más rápido(columna más corta, flujo más alto) Mayor sensibilidad(partícula más pequeña,pico más estrecho) Más optimizado (un análisis más rápido permite ajustar mejor) Ambos análisis en Agilent 11 G1315B DAD (bajo 4 bar) No se requiere cambio en la preparación de muestra, frita de entrada de 2 micras en ambas columnas. min min Page 17

18 Comparación de 4.6 x 25 mm 5 um con Poroshell 12 EC-C x 1 mm, 2.7um Ver condiciones en diapositiva anterior bar bar min Mejor Resolución, linea base!! 5 min Page 18

19 Ajustes de los parametros cromatograficos en la transferencia de métodos Escalado del volume de inyección v 1 x [(r 2 2 x L 2 )/(r 1 2 x L 1 )] = V 2 O bien v 2 = V 1 x [(d 2 2 x L 2 )/(d 1 2 x L 1 )] v: volume de inyección r: radio de la columna L: longitud de la columna Ajuste de la longitud del gradiente En función de la longitud de la columna L 2 /L 1 = tg 2 /tg 1 En función del volumen muerto de columna y del flujo t G2 = t G1 x (V 2 /V 1 ) x (F 1 /F 2 ) t: tiempos de gradiente V: volumen muerto de columna F: flujo Ajuste del flujo F 2 = F 1 x (L 2 /L 1 ) x (r 2 /r 1 ) 2 L: longitud de la columna F: Flujo r: radio de la columna Columna ID 4.6mm 3.mm 2.1mm 1.mm Volumen muerto aprox por mm longitud 1.mL 4.25mL 2.8mL.47mL Page 19

20 Comparación de Forma de Pico en Columnas Superficialmente Porosas Columnas: 4.6 x 5mm, Fase Móvil: 2 mm 4% Na2HPO4, ph 7. 6% Acetonitrilo Flujo: 1.5 ml/min Muestra: 2 ul inyección de 25 ug/ml amitriptilina, 5 ug/ml uracilo en H2O/CH3CN (9:1) Temp: 24 C Detector 254nm, Celda de Flujo2-uL 8 Poroshell 12 Tf = 1.48 Ascentis Express Tf = 2.68 Kinetex Tf = 4.78 Poroshell Ascentis Express Kinetex min Page 2

21 Page 21 Alta Velocidad y Resolución hasta 5 ml/minuto en el 129 Infinity LC con las columnas Poroshell 12

22 Qué producto Agilent recomendamos? Sub 2um o Poroshell 12 Para un HPLC (<4 bar) recomendamos Poroshell 12 A menos que la cromatografía requiera un escalado en tamaños de partícula Para un UHPLC(<12 bar) o RRLC (<6 bar) ambas alternativas son posibles. Considere cuales son sus objetivos y las aplicaciones que desarrolla. Sub 2um será una excelente elección para los UHPLCs de mayores presiones. Page 22

23 Guías de Selección de Columnas Agilent UHPLC Análisis Rápido Alta Rs (N) 4 bar LC Compatible 1+ bar UHPLC Compatible Poroshell 12, 6 bar X only 2.7um Escalabilidad de Partícula 1.8, 3.5um etc. ID s 4.6, 3. & 2.1 mm Muestras sucias? frita 2um RRHT, 6 bar <5mm RRHD, 12 bar X X (3. & 2.1) Page 23

24 Sub 2um vs. Poroshell 12 Análisis de 17 Amino Acidos en 129 Infinity min RRHT Eclipse Plus C18 Rs 6,5 = x 1mm, 1.8um 5 5 Rs 6,5 =1.98 W½ 9 =.43 min. W½ 9 =.45 min. Rs 14,13 =1.81 Rs 14,13 =1.81 Poroshell 12 EC-C18 3. x 1mm, 2.7um Pmax=331 bar F=.86 ml/min Pmax=474 bar F=.86 ml/min min RRHD Eclipse Plus C18 Rs 6,5 =2.9 W½ 9 =.36 min. 3. x 1mm, 1.8um Rs 14,13 =2.34 Pmax=528 bar F=.86 ml/min min Page 24 Group/Presentation Title Agilent Restricted Month ##, 2X

25 Qué hace diferente a la Poroshell 12 de otras Columnas de Partícula Superficialmente Porosas? El proceso de coacervación usado para hacer la cubierta exterior porosa en un solo paso, en vez de un proceso multicapa, reduce la variabilidad y genera más reproducibilidad La distribución de tamaño de partícula más estrecha, proporciona la mejor eficacia La mejor simetría de pico del mercado. TF muy próximos a 1, mejor que la competencia 25

26 Sumario Poroshell 12 es una nueva columna LC que complementa las soluciones de productividad de Agilent Es una nueva alternativa para LC de Alta Resolución y Alta Velocidad, que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC Con la Poroshell 12 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja presión. Puede usarse con muestras sucias, sin ver una elevación anormal de la presión. Puede usarse en un método USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de Método. El proceso de coacervación para ligar la capa externa porosa y la estrecha distribución del tamaño de partícula son los responsables de que la Poroshell 12 tenga la mejor reproducibilidad, la mejor forma de pico, la más alta eficacia, la menor presión y la mayor capacidad de pico entre todas las columnas superficialmente porosas del mercado. Page 26