Selección de métodos de Trabajo y Columnas para sus Aplicaciones en HPLC y GC-MS. Page 1

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1 Selección de métodos de Trabajo y Columnas para sus Aplicaciones en HPLC y GC-MS Page 1

2 Cuáles son la prácticas estándar en el desarrollo de métodos? 1. Elección del método más adecuado para la purificación de muestras y su clean-up de la muestra. 2. Seguir un esquema preferido en el desarrollo de métodos y probar distintas situaciones modificando los parámetros que varían la selectividad como el ph, la columna, o distintas fases móviles 3. Usar un software de desarrollo de métodos realizar analisis i predecibles y sacar conclusiones sobre el mejor método 4. Evaluar multiples columnas/multiples fases móviles de modo manual o automático, determinar los mejores resultados (i.e. usando valvulas de conmutación para cambiar entre columnas, software para evaluar picos, etc.)

3 Línea SampliQ SPE de Agilent. Solución completa de Agilent para SPE Nueva! Tecnología de Polímeros Caracterizados por su alta retención, excepcional recuperación y excelente reproducibilidad en un amplio rango de solventes y soluciones. Basados en Sílica Disponibles en fase reversa (nopolar), normal (polar) e intercambio iónico con enlaces trifuncionales que proporcionan una mayor estabilidad. Otras fases Fases de Florisil PR, aluminas y carbono indicadas para aplicaciones especiales. Sorbentes especiales de modo mixto que proporcionan mecanismos de retencion duales. Sorbentes a granel y QuEChERS Completa seleccion de sorbentes a granel para empaquetar sus propios cartuchos, así como una linea completa de sorbentes y sales para QuEChERS. Page 3

4 Qué son los Polimeros SampliQ? Caracteristicas: Alta retención,, excepcional recuperación y excelente reproducibilidad Gran robusted de los sorbentes: si el cartucho se seca accidentalmente durante el proceso de SPE, no habrá riesgo de perder analitos y/o reproducibilidad Compatibilidad con la mayoría de los solventes orgánicos y soluciones acuosas en un rango de ph range de 0 a 14 Partículas esféricas y estrecha distribución de tamaños, que aseguran un flujo reproducible Especificaciones: spherical particles 30 y 60 μm Tamaño de poro 74-80Å (medida BET) pore size 1000Å (medida de exclusión por tamaño inverso) Area superficial m 2 /g Control de calidad de las partículas Deteccion Electrozona (tamaño) Microscopia de luz (forma) Espectrometria de masas (contaminantes) Control de Calidad de la Resina: Test de empaquetamiento de cartucho Test de pureza de cartucho (GC) Test de pureza de la frita(gc) Comprobación del peso Resistencia al flujo del cartucho Extracción de Residuo (%) Turbidez (NTU) Page 4

5 Rendimiento robusto de los Polímeros DRY WET DRY WET DRY WET DRY WET DRY WET DRY WET DRY WET acetaminophen brompheniramine 1 propranolol mianserin doxepin fluoxetine Dihydroxy naphthalene Recuperaciones altamente reproducibles en húmedo o seco Cartuchos secados al vacío durante 10 minutos antes del paso de equilibración RSD s de recuperaciones para cada compuesto (n=5) muy bajo Rango de compuestos desded básicos muy polares hasta hidrofóbicos y neutros. Page 5

6 Polimeros SampliQ OPT e Intercambio Ionico Fuerte Resin Resin O R N R SO - 3 R OPT x-stream R 1 R 2 N R 3 OPT Polimero de poliamida Tiene afinidad por compuestos hidrofóbicos e hidrofílicos SCX Resin SCX Polimero de divinilbenzeno modificado d con áid ácido sulfónico Tiene afinidad de modo mixto para compuestos básicos y neutros R 1 SAX resin R 2 SAX Polimero de divinilbenzeno modificado con una amina terciaria Tiene afinidad de modo mixto para compuestos acidos y neutros Page 6

7 Recuperaciones y Reproducibilidad de Antibióticos en un extracto de miel con el sorbente polimérico SampliQ-OPT Agilent Pub# EN Page 7

8 Recuperaciones y Reproducibilidad para β-agonistas g en Cerdo con Intercambiador cationico fuerte SampliQ-SCX Agilent Pub# EN Page 8

9 SampliQ WAX La Resina WAX (weak anion exchanger) es un polimero divinilbenceno modificado con una amina neutra. Su pka ~6 Muestra retención acídica/aniónica, neutros y ácidos fuertes (e.g. sulfonatos) que se retienen irreversiblemente en las resinas de intercambio aniónico fuerte El grupo amina funcional (pka ~ 6) puede estar ionizado o neutro (dependiendo del ph del tampón); al contrario de las resinas de intercambio aniónico fuerte (SAX, siempre ionizado, i pka ~18) WAX ofrece un rango de ph más amplio Las resinas de intercambio aniónico débil exhiben un mecanismo mixto de comportamiento: intercambio aniónico y fase reversa. La resina WAX es estable en el rango de ph de 0 a 14, y se puede humedecer con agua(water-wettable) wettable) Page 9

10 Rendimientos de la Resina SampliQ WAX(intercambiador anionico débil) en la Extracción de Compuestos Ácidos/anionicos i i y Neutros de Plasma Humano Excepcional Recuperación con SampliQ WAX Acidic Compound 0 Recovery e from SampliQ WAX

11 SampliQ WCX La resina WCX (weak cation exchanger) es un polimero divinilbenceno modificado con un ácido carboxílico modificado neutro. Muestra retención básica/aniónica, neutros y bases fuertes (e.g. aminas cuaternarias) que se retienen irreversiblemente en las resinas de intercambio cationico fuerte El grupo carboxilo funcional (pka ~ 5) puede estar ionizado o neutro (dependiendo del ph del tampón); al contrario de las resinas de intercambio catiónico fuerte SCX, siempre ionizado a todos los phs, WCX ofrece un rango de ph más amplio Las resinas WCX exhiben un mecanismo mixto de comportamiento: t intercambio catiónico y fase reversa. La resina WCX es estable en el rango de ph de 0 a 14, y se puede humedecer con agua(water-wettable) Page 11

12 Rendimientos de la Resina SampliQ WCX (intercambiador catiónico débil) en la Extracción de Compuestos Fuertemente t Básicos/Catiónicos i y Neutros Basic Compounds Eluted by WCX Basic Compounds Atenolol Protryptyline Chlorpromazine

13 Agilent SampliQ Polymeric A/N/B Method Neutral Compounds Strong Acids Weak Bases Weak Acids pka <1 pka 2-10 pka 2-8 pka 3-10 Analyte: Log P < 1.5 Log P < 1.5 Use: SampliQ WAX Use: SampliQ SCX Log P > 1.3 Use: SampliQ OPT Use: SampliQ SAX Strong Bases pka >10 Use: SampliQ WCX Prepare Sample for SPE Condition: 0.1% Formic Acid in Methanol Methanol Methanol Equilibrate: 2% Formic Acid in Water Water Water Load: Prepared sample Prepared sample Prepared sample Wash: 5% - 10% Methanol in 2% Formic Acid 5% NH 4 OH Water Elute 1: Weak Acids 100% Methanol Methanol or 0.1% Formic Acid in Methanol 100% Methanol Weak Bases Elute 2: 5% NH 4 OH in Methanol 2% Formic Acid in Methanol Page 13 Strong Acids Weak Bases Neutrals Weak Acids Strong Bases

14 Metodos preparación de muestra tradicionales - SPE Prelavado* Preacondiciona miento Cargar Lavar Eluir Elimar contaminantes t que puedan eluir con el analito Preparar el cartucho Cargar muestra y Lavar con solvente que Eluir el analitio en para aceptar la muestra enjuagar cartucho) no eluya el analito volumen más pequeño posible 1 2 Si el solvente de elución es más fuerte que el solvente de preacondicionamiento 1. MeOH o ACN 2. Solvente débil (agua, tampón) Eluyen los componentes de la matriz deblimente retenidos Se retienen analitos y otros compuestos de la matriz Eluye el anallito dejando los compuestos altamente retenidos

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16 Qué es QuEChERS? Quick, Easy, Cheap, Effective, Robust and Safe, QuEChERS Método de Preparación de Muestra orientado a los mercados de Seguridad Alimentaria. Desarrollado conjuntamente por la USDA (2003) y por las Agencias Reguladoras de Alimentos Europeas (método pren 15662: 2007) Metodología para una extracción simplificada de un gran número de residuos de pesticidas multiclase y multiresiduo en frutas y vegetales. Mercado al que se dirige - Científicos en Seguridad Alimentaria que analizen residuos de pesticidas/herbicidas en frutas y vegetales - Agencias reguladoras/inspectoras del Gobierno - Compañías de proceso de alimentos y analisis medioambientales - Investigadores en la Universidad/Centros id d/c de Investigación Page 16

17 Primer Paso- Extracción Representación Gráfica de los pasos QuEchERS El uso de Sulfato Magnésico en el paso de extracción ayuda a mejorar las recuperaciones al facilitar la partición de los pesticidas en la capa orgánica, gracias a que retiene el agua.

18 Segundo Paso SPE Dispersiva Representación Gráfica de los pasos QuEchERS La SPE Dispersiva implica la mezcla de la sal y los sorbentes con el extracto en un tubo de centrífuga para retener las interferencias de matriz, pero no los analitos. Page 18

19 Guía de Selección de SampliQ QuEChERS Page 19

20 Aplicaciones Page 20

21 Analisis de Residuos de Pesticidas en Espinacas usando los kits AOAC QuEChERS Agilent SampliQ por GC/MS (Publication EN) En esta aplicación se describe el uso los kits AOAC de QuEChERS, en la preparación p de muestra mediante extracción y cleanup de 18 residuos de pesticidas multiclase, cromatografiables por GC en espinacas. Para evitar la pérdida significante de pesticidas planares causados por el carbon grafitizado(gcb) en la SPE dispersiva, se utilizó un método modificado con la adición de tolueno Los pesticidas del extracto de espinacas se analizaron entonces por cromatografía de gases/espectrometria de masas (GC/MS) operando en modo selective ion monitoring (SIM). Page 21

22 GC/MS de una extracción de espinacas por QuEChERS

23 Resultados del método original sin tolueno Page 23

24 Resultados del método modificado con tolueno Page 24

25 Tendencias actuales en la investigacion en QuEChERS En general la metodologia de QuEChERS se está expandiendo hacia otras areas además de frutas y vegetales. Analisis de pesticidas en aceites y alimentación infantil PAHs en pescados. Análisis de residuos de fármacos: Fármacos en Sangre Total Antihelmínticos en tejidos animales Farmacos veterinarios en tejidos animales (antibióticos (sulfonamida y quinolona) en higado de vaca.pub number , ) Page 25

26 Cuáles son la prácticas estándar en el desarrollo de métodos? 1. Elección del método más adecuado para la purificación de muestras y su clean-up. 2. Seguir un esquema preferido en el desarrollo de métodos y probar distintas situaciones modificando los parámetros que varían la selectividad como el ph, la columna, o distintas fases móviles 3. Evaluar multiples columnas/multiples fases móviles de modo manual o automático, determinar los mejores resultados (i.e. usando valvulas de conmutación para cambiar entre columnas, software para evaluar picos, etc.)

27 Cual sería un buen comienzo para el Desarrollo de Médotos según este modelo? 1. Elegimos una columna C18 muchas posibilidades, tecnología bien conocida a) Una columna corta reduce el tiempo de desarrollo de un método b) Tamaños pequeños de partícula proporcionan la resolucion deseada en menos tiempo c) Las nuevas columnas C18 puede mejorar los resultados basada en altas eficacias y mejores formas de pico 2. Elegimos una fase móvil simple fiable, que trabaje con muchas muestras a) Tampón fostato a ph 3, TFA, o ácido fórmico en la parte acuosa b) Acetonitrilo o metanol en la parte orgánica 3. Ajustar la fase móvil para conseguir la retención y resolución deseadas a) Adecuar la resolución de todos los picos, Rs 2.0 require la más alta eficacia b) La retención del primer pico preferiblemente debe ser al menos k=1 c) Tiempo de análisis por debajo de 20 min o más corto d) Nuevas columnas, columnas cortas con pequeños tamaños de partícula que proporcionen más eficacia y resolución en tiempos de analisis cortos, acelerando el desarrollo de métodos.

28 Parametros Típicos en el Desarrollo de Métodos- Efectos de la Selectividad, Eficacia y Retención en la Resolución 7.00 Lo Lo que que más más influye influye en la Resolución en la esresolución la Selectividad es la Selectividad Cambio Fase Estacionaria Cambio Fase Móvil Parámetros Típicos Desarrollo Métodos 6.00 Los Platos es lo más fácil de aumentar 5.00 Resolution Increase N Increase Alpha Increase k' R s = N ½ /4 ( -1)/ k /(k +1) Plates: Alpha: k :

29 Nuevas opciones de columnas para el Desarrollo de Métodos Estándar 1. Columnas más cortas con tamaños de partícula más pequeños Columnas Rapid Resolution High Throughput (RRHT) con tamaño de partícula de 1.8um y 600 bares 50mm o más cortas para un desarrollo de métodos más rápido Columnas más largas para maximizar la eficacia, con particulas de1.8um hasta 1200 bares-100 o 150mm Columnas de nucleo solido, Poroshell 120, de 2.7um hasta 600 bares. Muchas opciones de fases estacionarias para un esquema completo en el desarrollo de métodos 2. Fases Estacionarias mejoradas con un rendimiento escepcional Mejor forma de pico y eficacia dan lugar a una mayor resolución Críticas para los mejores métodos Las nuevas columnas Eclipse Plus proporcionan un rendimiento mejorado

30 USP and FDA Method Adjustment Criteria Method Adjustment Criteria for Column Dimensions Parameter Maximum Specifications Comments/Examples Column Length ± 70% 250mm 75mm 150mm 50mm ±50% (FDA ORA-LAB 5.4.5*) 4.6 mm 3.0 mm (-35%) Column Internal Diameter USP Column ID can be 4.6 mm 2.1 mm (-54%) adjusted d provided d linear velocity is constant** 3.0 mm 2.1 mm (-30%) Flow Rate ±50% Reduce as much as needed If you change to a smaller/ shorter Injection Volume must still meet detection limits and precision column make the appropriate change in injection volume Particle Size Reduce by up to 50% You can change column length and particle size to keep Rs same *For the current and official copy, check the Intranet at ** USP 30 Second Supplement Revisions, PF34(1)

31 Elija la mejor fase estacionaria para cada rango de ph StableBond, ph 1-6 Eclipse XDB, ph Grupos silanos voluminosos1. dimethylalquilsilanos 2. No desactivada extra Densely Bonded 2. doble-desactivación * R proprietaria O O O OH OH Si R R Si R R Si R R1 R1 R1 O O O O O CH3 Si CH3 CH3 Si CH3 CH3 Si CH3 CH3 Si CH3 CH3 Si CH3 CH3 CH3 Eclipse Plus, ph Mayor pureza de la sílice 2. Mejorada doble desactivación CH3 O Si CH3 CH3 O Si CH3 CH3 CH3 O Si CH3 CH3 O Si CH3 CH3 CH3 O Si CH3 Extend-C18, ph Estructura bidentada única 2. Doble desactivación C18 Si O C18 Si O Silica Support

32 Capacidad de carga de las columnas Page 32

33 Primeros pasos en un esquema de desarrollo de métodos PASO 1 Elige Eclipse Plus C18 Bajo ph Ajusta %ACN a 0.5 <k < 20 Resolución insuficiente Cambia % organico PASO 2 Resolucón insuficiente PASO 3 Cambia el modificador orgánico Ajusta % orgánico a 0.5 < k <20 Resolución insuficiente PASO Cambia fase estacionaria 4 Eclipse Plus C8, SB-C18, CN, Fenil, otra RP Primero i selecciona una fase estacionaria C18 o C8 de alta calidad para una buena retención y resolución con muestras típicas ácidas, básicas y neutras. Optimiza el componente organico de la fase movil para mejorar la selectividad Elige fases estacionarias alternativas para optimizar el método si es necesario Elige SB-C18 para ph 1-2 Con las nuevas columnas RRHT, estos pasos pueden hacerse rapidamente, haciendo posible encontrar el mejor método.

34 1. Comienza el Desarrollo de Métodos con columnas RRHT Diferentes ZORBAX RRHT C18 para maximizar la Selectividad 1 º Opción Mejor Resolución y Forma de Pico 2 º Opción Selectividad Altenativa debido al non-endcapping Eclipse Plus C18 StableBond SB-C18 Fase Móvil: (69:31) ACN: agua Flujo 1.5 ml/min. Temp: 30 C Detector: Single Quad ESI positive mode scan Columnas: RRHT 4.6 x 50 mm 1.8 um a Opción Eclipse Buena eficacia y forma de pico 3 Se puede mejorar la Resolución min Eclipse XDB-C18 Muestra: 1. anandamide (AEA) 2. Palmitoylethanolamide l th l id (PEA) 3. 2-arachinoylglycerol (2-AG) 4. Oleoylethanolamide (OEA) ª Opción V i d d F Resolución pobre, Para esta separación, mejor Otras opciones. 1 2,3 4 Extend-C Variedad en Fases Estacionarias para un desarrollo de métodos efectivo.

35 Desarrollo de métodos en fármacos propranolol pindolol dipyridamole disopyramide diltiazem

36 Comenzar a ph bajo, Ajustando el Organico Eclipse Plus C18. Fármacos Cardíacos con Acetonitrilo Column: ZORBAX RRHT Eclipse Plus C18, 4.6 x 50 mm, 1.8 m Fase Móvil: A: 25 mm NaH 2 PO 4, ph 3.0 B: ACN 400 Flujo: 2.0 ml/min Temperatura: 30 C Detección: UV 240 nm 300 Muestra: Fármacos Cardíacos 1.Pindolol 2. Diisopyridamida 3.Propranolol 4.Dipyridamol 5. Diltiazem mau mau mau 40% ACN RRHT Eclipse Plus C18 permite una muy rápida optimización del % orgánico en la fase móvil % ACN 60 20% ACN Buena Resolución Análisis Rápido Sin gasto de tiempo Para obtener este k en una columna de 25cm a 2 ml/min habría requerido 1.5 horas de analisis!! k= 44!! min

37 Desarrollo de Métodos- Cambio de Modificador Orgánico. Comparación de Acetonitrilo y MeOH mau mau Columna: ZORBAX RRHT Eclipse Plus C18, 4.6 x 50 mm, 1.8 m Fase Móvil: A: 25 mm NaH 2 PO 4, ph 3.0 B: organico Flujo: 2.0 ml/min Temperatura: 30 C Detección: UV 240 nm Muestra: Fármacos Cardíacos1.Pindolol 2. Disopyridamide 3.Propranolol 4.Diltiazem 5. Dipyridamole % ACN Resolución de los pares (2,3), (3,4), (4,5) 50% MeOH es mejor en MeOH. Pico 5 cambio selectividad Resolución del par crítico (1,2), es mejor en ACN

38 Por qué el ph es crítico en el desarrollo de métodos? qué compuestos son sensibles al ph? Cómo afecta el ph a la retención y a la resolución? Cómo afecta el ph al desarrollo del método? Cómo afecta el ph en al elección de la columna?

39 El Cambio de Retención debido al ph para Compuestos Ionizables es Clave en el Desarrollo de Métodos Los analitos no cargados tienen mejor retención (i.e. áid ácidos a bj bajo ph y bases a ph alto) lt) Los Silanoles en la sílica ionizan a ph medio, incrementando la retención de los analítos básicos (i.e posibles interacciones de intercambio iónico) Elija el ph de la fase móvil para optimizar la retención y la selectividad durante el desarrollo de métodos La Eclipse Plus puede usarse en un amplio rango de ph Existen otras alternativas para ph altos.

40 Primeros pasos en un esquema de desarrollo de métodos PASO 1 Elige Eclipse Plus C18 Bajo ph Ajusta %ACN a 0.5 <k < 20 Resolución insuficiente Cambia % organico PASO 2 Resolucón insuficiente PASO 3 Cambia el modificador orgánico Ajusta % orgánico a 0.5 < k <20 Resolución insuficiente PASO Cambia fase estacionaria 4 Eclipse Plus C8, SB-C18, CN, Fenil, otra RP Primero i selecciona una fase estacionaria C18 o C8 de alta calidad para una buena retención y resolución con muestras típicas ácidas, básicas y neutras. Optimiza el component organico de la fase movil para mejorar la selectividad Elige fases estacionarias alternativas para optimizar el método si es necesario Elige SB-C18 para ph 1-2 Con las nuevas columnas RRHT, estos pasos pueden hacerse rapidamente, haciendo posible encontrar el mejor método.

41 El cambio de retención por el ph para Compuestos Ionizables depende del compuesto Los analitos no cargados tienen mejor retención(i.e. ácidos a bajo ph y bases a alto ph) 12 retentio on time (min) Acetylsalicylic acid pka 3.5 Pyridine Codeine Procainamide Amphetamine pka 5.2 pka 8.0 pka 9.2 pka 9.9 Caffeine pka 14 Fase Móvil: 45% MeOH: 55% 20 mm Tampón Fosfato 0 ph 2.5 ph 6.5 ph 8 ph 11.5 ph

42 Ionización de la Silica El pka de la Sílica es 4-5 A ph 3, alrededor del 90% de los silanoles superficiales están protonados (neutral Si-OH) A ph 6, alrededor del 90% de los silanoles superficiales están ionizados (negativamente cargados Si-O - ) Entre ph 3 y 6 hay una mezcla de silanoles ionicos y neutrales, por lo tanto son posibles las interacciones de intercambio iónico. Pequeños cambios de ph pueden causar grandes cambios en el grado de ionización de los compuestos ionizables. Esto puede provocar grandes cambios de retención.

43 Retención vs. ph para Antihistaminas Básicas - Menos Variación en Retención a ph bajos Columna: Fase Móvil: Eclipse XDB-C8 4.6 x 150 mm, 5 m 75% 25 mm Tampón Fostato 25% Acetonitrilo Doxylamine Chlorpheniramine Triprolidine Diphenhydramine pka 4.4, 9.2 pka 9.1 pka 6.5 pka 9.0 Re etention Volume ml La retención no cambia en este rango ph Ligeros cambios de ph pueden cambiar dramáticamente la retención/selectividad Evalúe siempre los cambios de retención por ph durante el desarrollo de métodos

44 Esquema de Desarrollo de Métodos Añadiendo ph medio Desde ph bajo PASO 5 ZORBAX Eclipse Plus C18 ph 7 (6-9) mm tampón, Ajustar %ACN for 0.5 <k < 20 Resolución insuficiente PASO 6 Cambiar % orgánico Resolución insuficiente PASO 7 Cambiar Modificador Orgánico(MeOH) Ajustar % orgánico para 0.5 < k <20 Volver al PASO 6 Resolución insuficiente PASO 8 Try Eclipse Plus Phenyl-Hexyl, Eclipse XDB-CN, Phenyl or Bonus-RP Volver al PASO 5 El ph medio puede dar mejor selectividad. Puede ser más compatible con tu muestra. El proceso de investigación a ph medio es el mismo que a ph bajo Eclipse Plus proporciona un rendimiento excepcional a ph medio Si se busca una mejor selectividad deberían considerarse fases estacionarias alternativas

45 Las Diferencias de Selectividad a ph 2 y ph 7 Pueden ser Dramáticas 1. Acetaminofen 2. Cafeina 3. Ácido Acetilsalicílico 4. desconocido Eclipse Plus C8 4.6 x 50mm, 5 um 1 3 ph min. ph 7.0 min Columna: 4.6 x 50, 5 um PN Gradiente: 10-60% B/3 min. ph 2.7: A: 0.1% ácido fórmico B: 0.1% fa en ACN ph 7.0: A 20 mm Na fosfato B: ACN Muestra: Comprimido genérico Excedrin min La Selectividad puede cambiar dramáticamente de ph 2 7 with con muchas muestras, como este comprimido analgésico. Eclipse Plus puede ser usada en ambas condiciones

46 Desarrollo de Métodos a ph Alto una Tercera Opción Desde ph Medio ZORBAX Extend-C18 PASO 9 ph 10.5 (9-12) 5 mm amonio, o TEA, o mm orgánico o tampones borato T = 25 C (ambiente 40 C) Ajustar MeOH para 0.5 <k < 20 Resolución insuficiente PASO 10 Cambiar modificador orgánico (ACN or THF) Ajustar parar 0.5 < k<20 Razones para usar ph Alto Incrementar la retención de los compuestos básicos analizándolos en su forma no cargada Mejorar j la selectividad id d Probar otro modo de HPLC

47 El ph Alto Aumenta la Retención de Antihistaminas Extend-C18 Columna: ZORBAX Extend-C18, 4.6 x 150 mm, 5 m Fase Móvil: ver abajo Flujo: 1.0 ml/min Temperatura: RT Detección: UV 254 nm Muestra:l: 1. Maleato 2. Scopolamina 3. Pseudoefedrina 4. Doxylamina 5. Clorfeniramina 6. Triprolidina 7. Difenhidramina ph 7 ph 11 30% 20 mm Na 2 HPO 4 30% 20 mm TEA 70% MeOH 70% MeOH 1 2, t 5 R = 8.5 t 1 R = Time (min) Time (min) La retención de esta muestra de compuestos básicos aumenta a ph alto.

48 Cómo incrementar las capacidades de su HPLC convencional: nuevas columnas Poroshell 120, una nueva era en el desarrollo tecnológico de las columnas de HPLC Columns HPLC Agilent Poroshell Dispare su productividad en LC Page 48

49 Poroshell 120 Una nueva aproximación a la Alta Resolución y la Alta Velocidad en LC Poroshell 120 es una columna de alta eficacia y alta resolución para mejorar la productividad en un HPLC o UHPLC. Para separaciones de alta resolución en equipos 1200, 1100 y otros HPLCs (Presión < 400 bar). Columnas de 4.6 y 3.0 mm ID de gran volumen para cualquier HPLC Columnas de 2.1 mm ID adecuadas para LC/MS y sistemas optimizados para bajos volumenes de columna. Para separaciones de alta presión en equipos 1200 RRLC, 1290 Infinity u otros UHPLC con Presión > 400 bar La columnas Poroshell 120 largas proporcionan una elevada eficacia (un columna o dos columnas en serie). October Page 4918, 2010

50 Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC: Las Columnas Poroshell 120 tienen: 80-90% de eficicacia de las sub 2um A presiones un ~40-50% más bajas Con un tamaño de partícula de 2.7um Con una frita de entrada de 2um Con un límite de presión de 600 bar La partícula tiene un núcleo sólido (1.7um) y una cubierta exterior porosa de 0.5um como zona de difusión Page 50 Confidentialit October

51 Qué hace diferente a la Poroshell 120 de otras Columnas de Partícula Superficialmente Porosas? El proceso de coacervación usado para hacer la cubierta exterior porosa en un solo paso, en vez de un proceso multicapa, reduce la variabilidad y genera más reproducibilidad La distribución de tamaño de partícula más estrecha con una relacion 90%/10% de 1.16, proporciona la mejor eficacia La mejor simetría de pico del mercado. TF muy próximos a 1, mejor que la competencia 51 Confidentialit October

52 Van Deemter La Teoría Termino C la resistencia alatransferencia de masa se mejora por Reducción en el tamaño de partícula esta es la aproximación más común Mejorando la difusión Altura de Plato Te eórico H H min A menor Altura de Plato Teorico H, mejor Resolución H = A + B/u + C x u Difusión Longitudinal (B) Partícula grande Particula pequeña Curva Van-Deemter resultante Resistencia a la Transferencia de Masas (C) u opt (A)Multipath Term Flujo lineal u Page 52

53 Qué partes de la equación Knox/VanDeemter se ven afectadas por la partícula de la columna? Término A difusión eddy y distribución de flujo La partícula impacta el Término A Tanto el tamaño de partícula como la calidad d del empaquetamiento t influyen en el término A Una ajustada distribución del tamaño de partícula mejora el término A Término B difusión longitudinal La partícula tambien impacta en el Término B Este término se ve impactado por el tamaño de poro de la partícula Término C componente de la Transferencia de Masa La partícula y sus propiedades impactan en el Término C La Transferencia de Masa se mejora usando partículas más pequeñas con rutas de difusión más cortas Et Esto se mejora mucho con partículas superficialmente i porosas Esto permite obtener alta eficacia a flujos altos Page 53

54 Columnas Poroshell 120 de 150mm HPLC o UHPLC Condiciones: Columna: Poroshell 120 EC-C18, C x 150mm, 2.7um Fase Móvil: Solvente A: Agua con 0.1% Ácido Fórmico Solvente B: Acetonitrilo 1200 SL temperatura controlada a 25 C Celda de Flujo 2 ul 1. Hidroquinona 2. Resourcinol 3. Catecol mau 2 ml/min P = 538 bar Fenol Nitrofenol 6. p-cresol o-cresol Nitrofenol 9. 3,4 di metil fenol ,3 di metil fenol ,5 di metil fenol naftol mau min ml/min P = 285 bar % min Gradiente: 1mL/min Time%B 6.0 5% Gradiente: 2mL/min Time%B 3.0 5% % Page 54

55 Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea Muestras Complejas- Plasma Pressure Columna: Poroshell 120 EC-C18, 3.0 x 50mm, 2.7um LC: Agilent 1200 RRLC (SL) Muestra: Plasma Precipitado: 2 partes Plasma: 7 Partes 20/80 Agua-MeCN w/0.1 % Ácido Fórmico con 1 Parte de Diflusinal en 50/50 Agua-MeCN 10 ug/ml (Concentracion Final Diflusinal 1 ug/ml) Agitado y dejado reposar 10 minutos No Centrifugado/ No Filtrado Volumen de Inyección: 1ul Diflusinal in Plasma Solvente A: Agua w/0.1 % TFA Solvente B: MeCN w/0.08 % TFA Flujo 1 ml/min 1 ul inyección Injections Efficiency (N) Tiempo %B End Press Plates 'Diflunisal' es un anti-inflamatorio no esteroidal análogo alaaspirina aspirina. desarrollado por Merck Sharp & Dohme. Page 55

56 Comparación de 4.6 x 250 mm 5 um con Poroshell 120 EC-C18 C x 100 mm, 2.7um mau Tiempo %B Columna: Eclipse Plus C x 250mm, 5um Flujo: 1 ml/min 110 bar Fase Móvil: A: 0.1% Ácido Fórmico en Agua B: 0.1% Ácido Fórmico en ACN Tiempo %B Columna: 4.6 x 100mm Poroshell 120 EC-C18, C18 2.7um Flujo: 1.85 ml/min Sulfadiazina, Sulfatiazol Sulfapiridina Sulfamerazina, Sulfametazina, Sulfametazol, Sulfametoxipiridazina, Sulfacloropiridazina Sulfametoxazol, Sulfadimetoxina mAU min Análisis i más rápido(columna más corta, flujo más alto) Mayor sensibilidad(partícula más pequeña,pico más estrecho) Más optimizado (un análisis más rápido permite ajustar mejor) Ambos análisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar) 3qp No se requiere cambio en la preparaciónp de muestra, frita de entrada de 2 micras en ambas columnas. 325 bar min Page 56

57 Guías de Selección de Columnas Agilent UHPLC Poroshell Análisis Rápido Alta Rs (N) 400 bar LC Compatible bar UHPLC Compatible Escalabilidad de Partícula 1.8, 3.5um etc. ID s 4.6, 3.0 & mm Muestras sucias? 120, 600 X bar frita 2um RRHT, 600 bar only 2.7um <50mm RRHD, 1200 bar X X (3.0 & 21) 2.1) Page 57

58 Poroshell 300 Fue la primera columna Poroshell de Agilent (2003) Separaciones Rápidas y de Alta Resolución de Polipéptidos y Proteinas Poroshell es más que Poroshell 120. Es una de las alternativas para la industria Farmacéutica y Biofarmacéutica Cubierta Porosa NÚCLEO SÓLIDO 5 um Las Columnas Poroshell 300 son para separaciones de grandes péptidos y proteinas Las Partículas Poroshell 300 tienen un núcleo sólido de silice con una cubierta superficial porosa de 300Å de tamaño de poro. Esto resulta en una transferencia de masa más eficaz, picos más estrechos y separaciones rápidas y eficaces de grandes proteinas and péptidos Page 58 Group/Presentation Title Agilent Restricted

59 Poroshell 120 vs. Poroshell 300 Use Poroshell 120 para mapeo peptídico. Peptidos de la digestión de proteinas o anticuerpos monoclonales Las separaciones típicas de gradiente funcionan bien. Use flujos de 0.5 ml/min o mayores para separaciones rápidas en columnas 2.1 mm ID Use Poroshell 120 EC-C18 para aplicaciones LC/MS con ácido fórmico. Use Poroshell 300 para biomolecules más grandes Si toda la muestra son polipéptides o moléculas mayores Se puede usar con proteinas muy grandes. Use un flujo alto para una eficacia óptima (i.e. 1.0mL/min en columnas de 2.1 mm ID) Page 59

60 Flujos Altos con 2.1 mm ID Poroshell 300 para Separaciones Rápidas y de Alta Resolución Columna: Poroshell 300SB-C18 21x75mm 2.1 mm, 5um Fase Móvil:A: 0.1% TFA B: 0.07% TFA en ACN Gradiente: 5 100% B en 1.0 min. Flujo: 3.0 ml/min. Temperatura: 70 C Presión: 250 bar Detección: UV 215 nm Muestra: 1. Angiotensina II 2. Neurotensina 3. Rnasa 4. Insulina 5. Lisozima 6. Mioglobina 7.Anhidrasa Carbónica 8.Ovalbumina Time (min) Poroshell 300 puede proporcionar alta eficacia a flujos más altos para separaciones extremadamente rápidas de proteinas and péptidos. Esto es debido a una transferencia de masa más rápida de las partículas superficialmente porosas. Page 60 Group/Presentation Title Agilent Restricted

61 Conclusiones La elección de la técnica de tratamiento de muestra es crucial en el análisis cromatográfico (SPE, Quechers, extracciones ). Ya que muchos compuestos son ionizables, y el ph tiene un gran impacto en la retención y selectividad de estos compuestos, los esquemas de desarrollo de métodos deberían contemplar las variaciones de ph. Cualquier esquema de desarrollo de métodos debería incluir también el uso de diferentes fases estacionarias. Las Diferentes fases estacionarias y columnas pueden ser también seleccionadas por ph. El tercer aspecto clave en el desarrollo de métodos es la fase móvil y el modificador orgánico, ya que es determinante en muchas separaciones. ac es Nuevas columnas, como las 1.8um RRHT,Poroshell 120 y fases estacionarias como Eclipse Plus pueden mejorar los enfoques típicos del desarrollo de métodos..

62 HMUCHAS GRACIAS!!!! Page 62