Optimización Condiciones de Separación en HPLC

Transcripción

1 Isidro Masana Químico de Aplicaciones 17 de Octubre, 2003 Optimización Condiciones de Separación en HPLC Horario: a.m. CET Teléfono: (desde España) (desde fuera de España) Coordinador: José Monge Slide 1

2 Optimización Condiciones de Separación en HPLC 1.-Recopilación Información 2.-Selección Columna Selección Fase Estacionaria Selección Dimensiones Columna y Relleno 3.-Estrategias Optimización Composición del Eluyente Optimización en Condiciones Isocráticas Optimización en Condiciones de Gradientes Slide 4

3 1.- Recopilación Información Slide 5

4 Recopilación Información La puesta a punto de un nuevo método analítico suele ser muy laboriosa, toda fuente de información que permita reducir el tiempo de experimentación será de gran ayuda. Estudiar toda fuente de información: Experiencia personal, aunque sólo sea en productos parecidos. Contactar con gente del sector con posible experiencia en la analítica de interés. Bibliográfica Internet: Búsqueda notas de aplicación Agilent Technologies: Búsqueda de cromatogramas Agilent Technologies: Web Agilent Technologies: Web Agilent Technologies en castellano: US EPA, Pesticides: Analytical Methods & Procedures: US EPA: Index of Residue Analytical Methods List 1 - B: OBJETIVO: Reducir en la medida de lo posible la LABORIOSA y COSTOSA EXPERIMENTACIÓN en Laboratorio Slide 6

5 2.- Selección Columna C3 - C8 - C18 Fenilo - CN - Silica? StableBond Eclipse XDB Bonus-RP Extend???? Fase Normal - Reversa - Intercambio Iónico - GPC - GPC? D.I.: mm? Long.: µm? T.P.: µm? Slide 7

6 Selección Fase Estacionaria RECURRIR A TABLAS DE SELECCIÓN DE FASE ESTACIONARIA/MÓVIL Tener en cuenta M analito: M < 2000 emplear columnas porosidad 60 a 120 A M > 2000 emplear columnas porosidad > 300 A Tener en cuenta incompatibilidades/limitaciones de las columnas: COLUMNAS DE SILICA: 2 < ph < 9 (excepto con Zorbax Extended: ph < 11.5) Alta Resistencia Mecánica COLUMNAS POLIMERICAS 1 < ph < 13 (excepto con Zorbax StableBond: 1 < ph y 90º C18) Baja Resistencia Mecánica Para trabajar en Fase Reversa con fases móviles 100% acuosas se recomienda (para evitar el colapso de la fase estacionaria) la utilización de columnas que tengan insertado un grupo polar en medio de la cadena alquílica (hidrofóbica) (p.e. una amida en las Zorbax Bonus-RP). Columnas AMINO son incompatibles con ALDEHIDOS y CETONAS (por formación bases de Schiff). Temperatura: sino se indica lo contrario se recomienda trabajar a < 60ºC, o a <40ºC si se trabaja a ph s neutros o básicos (si la presión no es elevada - temperaturas bajas pueden prolongar la vida de la columna) Slide 8

7 Selección Genérica de Fases Móviles / Estacionarias Muestra Peso Molecular inferior a 2000 Solubilidad Soluble en disolvente orgánico Prop. Muestra Soluble en n-hexano (no polar) Soluble en Etanol (moderadamen te polar) No iónica 1ª Opción Fase reversa no acuosa C18* b Fase Normal: CN * c Fase reversa C18, C8* b Fase Móvil MeOH, ACN, Isopropanol, THF, CH 2 Cl 2, n-hexano* a * a Ojo MeOH y ACN no son totalmente miscibles con n-hexano Empezar con n- Hexano, adicionar CH 2 Cl 2, AcOEt, THF Isopropanol MeOH/Agua ACN/ Agua 2ª Opción Adsorción (líquidosólido): Sílica F.Nor.: CN * c F. Nor.:NH2, Adsorción: Sílica NH2, CN * c Fase Móvil Empezar con n- Hexano, adicionar CH 2 Cl 2, AcOEt, THF, Isopropanol Empezar con n- Hexano, adicionar CH 2 Cl 2, AcOEt, THF, Isopropanol MeOH/Agua ACN/Agua Peso Peso Molecular Molecular Analitos Analitos Soluble en agua Soluble en disolvente orgánico Peso Molecular superior a 2000 Soluble en agua * b Por ejemplo una Zorbax Eclipse XDB C18 ó C8 (XDB) * c Por ejemplo una Zorbax StableBond CN (SB-CN) Ionizable Iónica * d Por ejemplo una Zorbax 300-StableBond o 300-Extended Fase reversa con Control ionización C18, C8 Par iónico C18 Permeación de gel GPC Filtración de gel GFC Fase reversa* d C1 C18 de poro ancho Intercambio iónico Tampones en MeOH/Agua ACN/Agua HSA (para +) o TBA (para -) en tampónes MeOH-ACN/Agua THF, Tolueno, Cloroformo Agua o soluciones tampón MeOH/Agua ACN/Agua Soluciones Tampón Par Iónico C18 SCX, SAX Intercambio HSA (para +) o TBA (para -) en tampónes MeOH-ACN/Agua Soluciones tampón que varíen en fuerza iónica y ph HSA: ácido hexanosulfónico TBA: hidróxido tetrabutilamonio THF: tetrahidrofurano MeOH: metanol ACN: acetonitrilo Slide 9

8 Características Genéricas de algunas Fases Estacionarias FASE Grupo Grupo Orgánico Si-C Aplicaciones Típicas C18 ODS C8 - MOS C3 Octadecil Octil Propil -(CH 2 ) 17 -CH 3 -(CH 2 ) 7 -CH -(CH 2 ) 3 -CH 3 Separación de compuestos no polares a compuestos de moderada polaridad Separación de compuestos de moderada a elevada polaridad (solubles en agua) Separación de péptidos y proteínas C 6 H 5 Fenil -(CH 2 ) 3 - Compuestos de polaridad moderada CN Ciano (Nitrilo) -(CH 2 ) 3 -CN NP:Separa compuestos polares de forma similar a la sílice no modificada / RP: Retiene menos que una C18 los compuestos apolares y algo más los compuestos muy polares NO 2 Nitro -(CH 2 ) 3 - -NO 2 Separación de compuestos con dobles enlaces NH 2 -APS Amino -(CH 2 ) 3 -NH 2 Utilizable en 3 modos distintos: fase normal, intercambio aniónico débil y fase reversa de compuestos polares. N(CH 3 ) 2 Dimetilamino -(CH 2 ) 3 -N(CH 3 ) 2 Igual que la fase Amino OH Diol Ácido sulfónico Amonio Cuaternario -(CH 2 ) 3 -O-CH 2 -CHOH-CH 2 OH SCX -(CH 2 ) 3 - -SO 3 Na + SAX (CH 2 ) 3 - -CH 2 -N-(CH + 3 ) 3 Cl - - Es menos polar que la sílice no modificada Cromatografía de Intercambio iónico. Intercambiador catiónico. Cromatografía de Intercambio iónico. Intercambiador aniónico. Slide 10

9 Análisis Compuestos Ionizables: Interacciones Columnas Base Silica No Protegidas La coexistencia de más de 1 mecanismo de separación (p.e. Partición + intercambio iónico) puede dar lugar a la formación de colas en los picos y pérdida de Partícula Sílice Porosa repetibilidad del método Zorbax Partícula Sílice: Si-OH Si-O - + H + Analito básico Original ZORBAX SIL (1973) Adsorción + intercambio catiónico Los silanoles ionizados efectuaran intercambio catiónico con las bases protonadas NH + R 3, dando lugar a la formación colas en los picos y reduciendo la repetibilidad del método. La presencia de metales en la sílice incrementa la presencia de estos silanoles y aumenta la asimetría en compuestos básicos Sólo Adsorción Highly Purified (99.995%) ZORBAX Rx-SIL Analito ácido Los ácidos desprotonados (carboxilatos) podrán competir por el protón de los silanoles no ionizados, dando lugar a la formación colas en los picos y reduciendo la repetibilidad del método Con columnas Base Sílice y Analitos Ionizables se deberán tener presentes las posibles interacciones entre ambos Slide 11

10 Estrategias Análisis de Compuestos Ionizables Básicos Estrategia A: Trabajar a ph< 3 NO interaccionan: Sílice NO Ionizada Analito Básico Ionizado +a* Estrategia B: Trabajar a 3 <ph< 8 SI interaccionan: Sílice Ionizada Analito Básico Ionizado + Estrategia C: Trabajar a ph >8-9 NO interaccionan: Sílice Ionizada Analito Básico NO Ionizado b* Retención en C18 de un Analito Básico con un pk a =6.5 Carga Analito = Positiva a* al estar ionizado disminuirá su retención en RP b* compuestos muy básicos podrían aún estar ionizados Carga Analito = Neutra La estrategia A (a ph ácido) suele ser la 1ª a probar Con columnas Base Sílice y Analitos Ionizables se recomienda escoger un tipo de columna adecuada dependiendo de la estrategia utilizada para minimizar posibles interacciones analito-silanoles Consideraciones en Zona B: Al poder estar analito y silica cargados +/- pueden establecerse interacciones secundarias del tipo intercambio iónico (además de la primaria de partición) pudiéndose producir la aparición de colas en el pico. Por ello se recomienda en este caso utilizar columnas tipo End Capped o añadir aditivos (p.e. 1%AcNH 4 / 20mM TEA/...) en fase móvil para disminuir las colas. Será importante una buena capacidad tamponadora y control del ph (especialmente en la zona ph 5-8 y alrededor del pk a del analito) para una buena reproducibilidad de tiempos de retención. Slide 12

11 Análisis Compuestos Ionizables: Selección Tipo de Columna para una Resolución Duradera Para una Resolución Duradera utilizar un tipo de columna optimizada para el ph de trabajo Estrategia A (a ph ácido) Estrategia B (a ph s medios) Estrategia C (a ph básico) Retención Tolueno a ph=0.8 y 90ºC Las columnas Zorbax tipo STABLEBOND ofrecen una larga vida incluso a ph s muy ácidos Zorbax STABLEBOND 3 meses Volúmenes de columna bombeados a su través El desarrollo de métodos con columnas Base Sílice y Analitos Ionizables suele empezar probando la estrategia A con una columna tipo Zorbax StableBond. Rango ph 1 6(8) (2)3 8(9) (2)3 8(9) (2) Los voluminosos grupos (R) diisobutilo (C18) o diisopropilo (C8,C3,CN,Aq, Fenilo) de las cadenas laterales estabilizan el enlace de las columnas Zorbax StableBond y le proporcionan una larga vida a ph s muy ácidos incluso a altas temperaturas Estrategia A: Trabajar a ph < 3 : Sílice no Ionizada NO Interacciona con analitos Básicos Analito Básicos estarán totalmente Ionizados + (si su densidad de carga es muy elevada podrían ser poco retenidos) Compuestos ácidos estarán no ionizados (excepto ácidos pk a < 4) y así se maximizará su retención mediante RP y se evitará su interacción con los silanoles ácidos para competir por su protón: analito Slide 13

12 Esquema de Optimización de Compuestos Ionizables para una Resolución Duradera según Estrategia A : Zorbax StableBond y ph<3 Compuestos Básicos inestables a ph s ácidos Paso 1a Añada 20 mm TEA o Acetato TEA o 1% AcNH4 Reajuste el ph. Paso 2a Varíe la temperatura hasta 80 C (90 C para SB-C18) Picos con cola Picos Solapados INICIO MUESTRA Separación Inicial ZORBAX SB-C18 o SB-C8 ph 2 (1-3), tampón mm T = 30 C (ambiente - 80 C) [90 C para SB-C18] Ajuste % ACN para 0,5 < k < 20 Problemas de Espaciado de los picos Paso 2 Aumente o disminuya el % de modif. orgánico en un 5% (v/v) Picos Solapados Cambie mod. org. a MeOH o TF Ajuste % orgánico para 0,5 < k < 20 Vuelva a comenzar en el PASO [2] Picos Solapados Cambie funcionalidad de fase ligada a SB-CN, SB-C3 o SB-Fenilo Vuelva a comenzar en el PASO [1] Picos Solapados Paso 1 Paso 3 Paso 4 Compuestos Básicos Poco Retenidos Picos Solapados Paso 1d Aumente o disminuya el % de modificador orgánico en un 5% (v/v) ZORBAX StableBond Ideal para ph < 3 Picos Solapados Paso 1b COMPUESTOS BÁSICOS Utilizar Par Iónico con MeOH y mm ácido hexanosulfónico, tampón 10 mm (ph 3) Ajuste % MeOH para 0,5<k <20 Picos Solapados Paso 1c Varíe la temperatura dentro del rango recomendado para la fase ligada. Picos Solapados Paso 1e Cambie modif. Orgán. a ACN o THF Ajuste para 0,5 < k < 20 Probar Estrategias B ó C Continuar Desarrollo con Estrategia B Probar Estrategia C Slide 14

13 Resumen* Optimización de Compuestos Ionizables según Estrategia A Empezar a bajo ph para una óptima reproducibilidad, retención y simetría de pico a largo plazo (si el analito no es estable utilizar estrategias B ó C) Empezar con StableBond C18 or C8 para máximo tiempo de vida Utilizar columnas de Resolución Rápida (3.5µm y p.e. 50 a 150mm de long.) para agilizar el desarrollo del método mM Tampón ph 1 3 para óptimo perfil del pico Si los picos presentan colas añadir al tampón 20mM TEA ó 1% AcNH 4 Empezar con un elevado porcentaje de acetonitrilo o metanol para el reconocimiento inicial de la muestra Ajustar % orgánico* para maximizar la resolución y ajustar la retención entre (0.5) 1<k <10 (20) Factor Capacidad: k = (t r -t 0 )/t 0 Si los compuestos básicos no se retienen añadir utilizar Par Iónico o la estrategia C Modificar selectividad cambiando a metanol, acetonitrilo o tetrahidrofurano si no se consigue suficiente resolución Modificar selectividad cambiando de fase estacionaria si no se consigue suficiente resolución: SB-CN, SB-Phenyl, SB-C3 Utilizar temperaturas elevadas 80ºC (90) si interesa reducir los tiempos de análisis. * Más adelante se presentará una estrategia para la optimización de la composición de fase móvil. Slide 15

14 Cambios de Selectivad con Distintas Fases Estacionarias Tipo StableBond Columnas: Fase móvil: Flujo: Temperatura: 26 C Detección UV: Muestra: ZORBAX StableBond 4,6 x 150 mm, 5 µm 0 100% B en 18,8 min A: 50 mm NaH2PO4, ph 2,5 en 95% H2O / 5% ACN B: 50 mm NaH2PO4, ph 2,5 en 47% H2O / 53% ACN 1,0 ml/min 254 nm 1. Procaina 2. Lidocaina 3. d-cinconina 4. Butacaina 5. Tetracaina Columna: Fase móvil: Flujo: ZORBAX SB 4,6 x 75 mm, 3,5 µm 30% ACN Temperatura: 35 C Muestra: 70% NaH2PO4, ph 2,5 1,0 ml/min 1. Estriol 2. Daidzen 3. Quercetin 4. Genistein 5. Dietilestilbestrol Las columnas CN puede llegar a permitir analizar en isocrático mezclas de compuestos polares y apolares, que con C18/C8 requerirían gradientes de concentración. Ello es posible gracias a que la fase CN, con respecto a una C18/C18 reduce la retención de los compuestos NO polares y aumenta la de los compuestos más polares. Es una buena opción para el análisis isocrático de analitos con muy distinta polaridad Slide 16

15 Incrementar la Temperatura para Reducir el Tiempo de Análisis Baja Temperatura Optimización Método Columna: Zorbax SB-C18, 4.6 x 75 mm, 5 mm Mobile Phase: 74% 7.4 mm hexano sulfonato y 0.07% ácido fosfórico 26% MeOH Flow Rate: 1 ml/min Detection: UV 280 nm Sample: Vitaminas B Alta Temperatura Acorta a 1/3 el tiempo análisis min. La posibilidad de trabajar a temperaturas elevadas permitirá agilizar la realización de pruebas para estudiar la influencia en la separación de distintos parámetros, la alta estabilidad térmica de las columnas StableBond: hasta 80ºC (90 para las SB-C18) amplían esta posibilidad. Slide 17

16 Especificaciones Rellenos Zorbax StableBond RECORDATORIO: para una buena repetibilidad de los tiempos de retención será especialmente importante un buen control del ph de la fase móvil, cuando éste sea próximo al pk a (+/-1 (2)) de alguno de los analitos, dada la gran variabilidad en su grado de ionización en esta zona x100 ph ph=pk+2 ph=pk+1 ph=pk ph=pk-1 ph=pk-2 Comp. Ácidos 99% ionización 90% ionización 50% ionización 10% ionización 1% ionización Comp. Básicos 1% ionización 10% ionización 50% ionización 90% ionización 99% ionización x100 Slide 18

17 Esquema de Optimización de Compuestos Ionizables para una Resolución Duradera según Estrategia B: Zorbax Eclipse XDB a ph 7 ESTRATEGIA B (3) 6<pH<8 (9). Estr. A Paso 6a Varíe la temperatura hasta 60 C Picos Solapados Sílice Ionizada Analito Básico Ionizado + SI interaccionan Paso 5 ZORBAX XDB-C18 o XDB-C8 ph 7 (6-9), tampón mm T = 30 C (ambiente - 40 C) Ajuste % MeOH para 0,5 < k < 20 Problemas de Espaciado de los picos Picos Solapados Paso 6 Aumente o disminuya el % de modif. orgánico en un 5% (v/v) Picos Solapados Paso 8 Cambie funcionalidad de fase ligada a XDB-Fenilo o Bonus-RP Vuelva a comenzar en el PASO [5] Paso 7 Cambie mod. org. a AcN o THF Ajuste % orgánico para 0,5 < k < 20 Vuelva a comenzar en el PASO [6] Compuestos Ácidos Poco Retenidos Picos Solapados Paso 5d Aumente o disminuya el % de modificador orgánico en un 5% (v/v) Probar Estrategia C Paso 5b COMPUESTOS ÁCIDOS Utilizar Par Iónico con MeOH y mm Tetrabutilamonio fosf. en tampón 10 mm (ph > 7) Ajuste % MeOH para 0,5<k <20 Picos Solapados Picos Solapados Picos Solapados Paso 5c Varíe la temperatura dentro del rango recomendado para la fase ligada. Paso 5e Cambie modif. Estr. Orgán. C a ACN o THF Ajuste para 0,5 < k < 20 Las columnas Zorbax Eclipse al estar doblemente desactivadas no requieren la adición de TEA ó AcNH4 para eliminar colas en compuestos básicos Slide 19

18 Resumen* Optimización de Compuestos Ionizables según Estrategia B a ph Medio Se deben utilizar columnas Desactivadas ( End Capped ) o añadir aditivos (p.e. 1%AcNH 4 / 20mM TEA/...) en fase móvil para disminuir las colas. Será importante una buena capacidad tamponadora y un buen control del ph. Si el compuesto ionizable no se resuelve bien a ph ácido (estrategia A), intentar ph medio p.e. ph 7 (6 8) con una fase doblemente desactivada como la Eclipse XDB-C18 o C8 y seguir el mismo proceso descrito para StableBond (slide 14 - excepto ph utilizado). En estas condiciones se suele aumentar la retención de los compuestos básicos con pk s inferiores o próximos al ph de trabajo (+ 1unidad ph). Si se requiere cambiar la selectividad utilizar la fase Eclipse XDB-Fenilo como alternativa. SB-C18, 4.6 x 75 mm, 3.5 mm Eclipse XDB-C18, 4.6 x 75 mm, 3.5 mm Al subir el ph de 3 a 7 disminuirá el ph 3 ph 7 grado de protonación de compuestos básicos débiles (pk s próximos a 7) aumentando su retención Time (min) Time (min) Fase móvil: 20% Metanol / 80% (20 mm fosfato+10 mm TEA ajust. ph 7) Flujo: 1.0 ml/min Temperatura: ambiente Detección: UV 254 nm Muestra: 1. Nizatidina 2. Famotidina 3. Cimetidina 4. Pirenzipina Slide 20

19 Esquema de Optimización de Compuestos Ionizables para una Resolución Duradera según Estrategia C a ph Básico con Zorbax Extended Estrategia C: Trabajar a ph > 9 (típico 10.5) Sílice Ionizada Analito Básico NO Ionizado b* NO interaccionan b* compuestos muy básicos podrían aún estar ionizados - Para optimizar seguir el mismo proceso descrito para StableBond (slide 14 - excepto ph utilizado). Paso 9 Estr. B ZORBAX Extended-C18 ph 10.5 (9-12), tampón 5mM NH4OH o TEA, o mm Borato u otro tamp. T = 25 C (ambiente - 40 C) Ajuste % MeOH para 0,5 < k < 20 Problemas de Espaciado de los picos Estr. C Paso 10a Varíe la temperatura hasta 60 C Picos Solapados Cambie a AcN o THF Ajuste el % de modif. orgánico para 0,5 < k < 20 Paso 10 Pruebe otro modo de HPLC Contacte con Agilent Technologies: tel Las columnas Zorbax Extended al estar doblemente desactivadas no requieren la adición de TEA ó AcNH4 para eliminar colas en compuestos básicos Slide 21

20 Ejemplo Compuestos Muy Básicos mediante Estrategia C Extend-C18 para una adecuada Retención y Eficacia a ph s muy básicos Columna: Zorbax Extend-C18, 4.6 x 150 mm, 5 mm Flujo: 1.0 ml/min Detección: UV 254 nm Temperatura: ambiente Muestra: 1. Procainamida pk a N-acetilprocainamida 3. N-propionilprocainamida 50% 25 mm Na 2 HPO 4, ph % MeOH Platos 1: : : Procainamida pk a 9.2 Al trabajar a ph 11 (2 unidades por encima del pk de la procaimida) está deja de estar protonada y aumenta muy apreciablemente la eficacia de la separación 50% 20 mm TEA, ph 11 50% MeOH Platos 1: : : Time (min) Time (min) La mayor simetría y retención obtenida a ph 11 proporcionará un método más robusto, aunque requerirá utilizar una columna como la Zorbax Extended-C18 adecuada para trabajar a ph s de hasta 11.5 Slide 22

21 Análisis de Compuestos Especialmente Difíciles mediante Fases Especiales COMPUESTOS MUY BÁSICOS Pueden presentar importantes colas Pueden ser difíciles de retener suficientemente (k >1 (0.5)) Opción 1 = ESTRATEGIA C: Zorbax Extend-C18 a elevado ph para mejor retención y simetría del pico Opción 2 = Estrategia B pero con columna Bonus-RP para mejor simetría del pico COMPUESTOS MUY POLARES Pueden ser difíciles de retener suficientemente (k >1 (0.5)) Pueden requerir altos porcentajes de fases acuosas Opción 1: SB-Aq para mayor retención con fases móviles altamente acuosas Opción 2: Bonus-RP para utilizar con fases móviles altamente acuosas Slide 23

22 Ejemplo Compuestos Muy Básicos mediante Opción 2 Bonus-RP para una óptima simetría Columna: 4.6 x 150 mm, 5 mm Fase Movil: A (col. Alquil C8) : 75% 25 mm NH 4 Ac, ph 5.5 / 25% ACN B (col. Bonus RP) : 80% 25 mm NH 4 Ac, ph 5.5 / 20% ACN Flow Rate: 1.5 ml/min Detection: UV 254 nm Sample: 1. Doxylamine 2. Chlorpheniramine 3. Triprolidine 1 A. Alquil C8 2 Factor de Cola 1: : 1.7 3: 2.1 B. Bonus-RP Factor de Cola 1 1: 1.1 2: 1.1 3: Grupo AMIDA Polar Time (min) Time (min) Permite trabajar a ph s muy ácidos El grupo amida (polar) insertado en medio de la cadena evita: 1.- Minimiza las interacciones analito-silanoles proporcionando una excelente simetría 2.- El colapso (plegamiento sobre si misma) de la cadena alquílica cuando se trabaja con soluciones totalmente acuosas. Slide 24

23 Ejemplo Compuestos Muy Polares mediante Opción 1 ZORBAX SB-Aq proporciona una excelente Retención de Compuestos Muy Polares 1 2 Columna: Zorbax SB-Aq, 4.6 x 150 mm, 5µm Fase Móvil: 90% 0.2% TFA 10% ACN Temperatura: 25 C Flujo: 1.5 ml/min. Detección: UV 254 nm Muestra: 1. Maleato 2. Fenilefrina 3 3. Fenilpropanolamina 4. Pyrilamina 5. Clorofenilamina Time (min) 16 Estos pequeños compuestos polares son difíciles de retener con la mayoría de columnas La SB-Aqproporciona una excelente retención incluso con un 90% de fase móvil acuosa, y admite ph s muy ácidos (1<pH<8) Slide 25

24 Selección Columnas Zorbax según Código USP (Farmacopea Americana) Código USP USP L1 USP L3 USP L7 USP L8 USP L9 USP L10 USP L11 USP L13 USP L14 USP L33 USP L35 Descripción C18 sílice porosa o micropart. cerám. 3 a 10 µm Sílice porosa 5 a 10 µm C8 en sílice porosa 5 a 10 µm -NH2 con sílice pososa 10µm Intercambio Catiónico fuertemente ácido CN en sílice porosa 3 a 10 µm Fenilo en sílice porosa 5 a 10 µm Trimetilsilano en sílice por µm Intercambio aniónico fuertemente básico de amonio cuaternario Relleno Esférico Base Sílice con Capacidad Separación Proteínas de a Daltons por SEC Opciones de Fases Estacionarias Zorbax (y otras ofrecidas por Agilent Technologies): Zorbax StableBond-C18 (SB-18) / Eclipse XDB-C18 (XDB-18) / Zorb. Rx-C18 / Zorb. ODS / Zorb. ODS classic / Hyp ODS / Hyp BDS- C18 / LiC RP-18 / Pur RP-18 / Sup RP-18 / Nuc C18 / Vy 218TP / SynC C18 Zorbax RX-Sil / Zorbax Sil / Hyp / LiC 60 SI Zorbax StableBond-C8 (SB-8) / Eclipse XDB-C8 (XDB-8) / Hyp MOS / Hyp BDS-C8 / LiCrospher RP-8 / LiCrospher RP-Select B Zorbax NH2 / Hyp APS / LiChrospher NH2 Zorbax SCX / SynChropack SCX Zorbax StableBond-CN (SB-CN) / Zorbax-CN /LiCrospher CN Zorbax StableBond-Fenilo (SB-Fenilo) / Eclipse XDB-Fenilo (XDB-Fenilo) / Zorbax-Fenilo Zorbax TMS Zorbax SAX / SynChropack SAX Zorbax GF-250 / Zorbax GF-450 Zorbax GF-250 Zorb.:Zorbax / LiC: Licrospher / Pur:Purospher / Sup:Superspher / Hyp: Hypersil / Nuc:Nucleosil / Vy:Vydac / Syn:SynChropak Slide 26

25 Selección de Fases Estacionarias según el ph de Fases Móviles Típicas en LC/MS Fases Estacionarias (Zorbax) StableBond Rx-C18 Típicas Fases Móviles en LC/MS TFA Ácido fuerte pk a < Formiato* pka = Acetato* pka = Hidróxido Amónico pka = 9.2 x x Eclipse XDB x Bonus-RP x Extend-C * Usado como ácidos fórmico ó acético o como sus respectivas sales amónicas +++ : Opción óptima ++ : Opción adecuada x : Opción inadecuada Slide 27

26 Fases Estacionarias Específicas Fase Estacionaria Zorbax Eclipse AAA Aminoquant ZORBAX Carbohydrate Anion Chromatography Kit Column PAH Columns ZORBAX Eclipse dsdna ZORBAX Oligo Aplicación Aminoácidos Mono y Disácaridos Aniones en Aguas (F,Cl,Br,PO4, NO2, NO3,SO4) mediante detección UV/VIS PAH s (Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos) Fragmentos DNA de doble cadena (dsdna) de p.b. (pares de base) Heterodeoxioligonucleótidos y purificación de oligonucleótidos Observaciones Análisis por Fase Reversa y derivatización automática precolumna (OPA+FMOC) con MeOH,AcN y tampón Fosfato (Zorbax) ó Acetato (Aminoquant) Columna base sílice funcionalizada con grupos amino para el Análisis de Azúcares por Fase Normal con mezclas Agua/Acetonitrilo Columna de Fase Reversa (Asahipak ODP-50) para análisis isocrático de Aniones con AcN/H2O+aditivo par iónico Análisis de PAH s mediante Fase Reversa y gradientes de concentración fragmentos PCR, DHPLC, RAPD, RFLP Fase base sílice tipo Diol para separación en Modo mixto intercambio iónico/ fase reversa de oligos Slide 28

27 Selección Dimensiones Columna y Tamaño del Relleno Long.: mm? StableBond C3 - C8 - C18 Fenilo - CN - Silica?? D.I.: mm? Eclipse XDB Bonus-RP Extend? Fase Normal - Reversa - Intercambio Iónico - GPC GFC T.P.: µm? Slide 30

28 Selección de la Longitud Columna y Tamaño de Partícula del Relleno La Eficacia aumenta con la reducción del tamaño de partícula El tiempo de análisis se reduce acortando la longitud de la columna. Reduciendo Longitud y Tamaño de partícula, pero manteniendo flujo y nº platos proporcionados por la columna, se conseguirá reducir el tiempo de análisis y consumo de disolvente sin perder Resolución. Nº Platos Longitud TP.:10 µm Columna TP.: 5 µm TP.: 3 µm 25cm cm cm cm Eluyente: CH Eluyente: CH 3 OH/H 3 OH/H 2 O/THF (15/60/25) 2 O/THF (15/60/25) Flujo: 1.5 ml/min Flujo: 1.5 ml/min Detector: UV-254 nm, 0.08 AUFS Detector: UV-254 nm, 0.08 AUFS Volumen muestra: 20 ml Volumen muestra: 20 ml Picos: Picos: 1.- Disolvente 1.- Disolvente 2.- Aldosterona, 0.01 mg/ml 2.- Aldosterona, 0.01 mg/ml 3.- Estriol, 0.1 mg/ml 3.- Estriol, 0.1 mg/ml 4.- Androstendiona, mg/ml 4.- Androstendiona, mg/ml 5.- Testosterona, mg/ml 5.- Testosterona, mg/ml 6.- Estrona, 0.5 mg/ml 6.- Estrona, 0.5 mg/ml b-Estradiol, 0.5 mg/ml b-Estradiol, 0.5 mg/ml 8.- Progesterona, 0.01 mg/ml 8.- Progesterona, 0.01 mg/ml 1 Longitud columna: 25 cm 5 Hypersil ODS, 5 µm 2 Longitud columna: 12 cm Hypersil ODS, 3 µm 5 7 Proporciona Igual Resolución y reduce en 7 8 más del 50% el tiempo de análisis y el consumo de disolvente 0 5 min. 0 3 min min/3.5min = Slide 31

29 Selección Diámetro Interno de la Columna: Aumento Sensibilidad y Ahorro Disolvente Reduciendo el D.I. de la columna, pero manteniendo la cantidad inyectada, se mejorará sensibilidad y se ahorrará disolvente. La resolución no cambiará siempre y cuando no se inyecte un volumen excesivo (dependerá del disolvente de la muestra) y la exigencia de un menor volumen muerto del sistema no la haga disminuir si el HPLC no está preparado para ello. Consumo Disolvente y Flujo: DI 2.1mm = DI 4.6mm / 5 DI 3mm = DI 4.6mm / 2.35 Sensibilidad: DI 2.1mm = DI 4.6mm x 5 DI 3mm = DI 4.6mm x 2.35 Volumen muerto conexiones+celda detector << Volumen muerto columna mau mm. 200 ng Bifenil Columna: Zorbax SB C18 0.5mm. Capilares de conexión a utilizar según D.I. columna D.I. Columna (mm) Máximo D.I. (mm) recomendable Código Capilares Metálicos 0.12 Rojo 0.17 Verde 0.25 Azul Código capilares PEEK Rojo (0.13) Amarillo (0.18) Azul 400 Ojo con las conexiones! 200 1mm mm. VOLUMEN MUERTO! min Slide 32

30 Mejora de la Sensibilidad con la Reducción del D.I. de la Columna Aplicación D.I. Columna Flujo típico Ganancia Teórica en Sensibilidad LC Estándar 4.6 mm 2.1 mm 1000 µl/min 200 µl/min ~1 ~ 5 Requerirá HPLC s adecuados Nano Capilar Micro LC 1 mm 800 µm LC Capilar 300 µm 180 µm Nano LC 100 µm 75 µm 50 µm 40 µl/min 20 µl/min 4 µl/min 2 µl/min 500 nl/min 250 nl/min 100 nl/min ~20 ~ 30 ~ 200 ~ 600 ~ 2000 ~ 3500 ~ 8500 x200 x10 Nano- Electrospray En Nano / Cap - LC se pueden inyectar volúmenes muy grandes (p.e. 8 µl en nano-lc) mediante configuraciones multi-válvulas. La Nano-LC interesa cuando se dispone de muy poca de muestra y/o se requiere máxima sensibilidad (p.e. en Proteómica). Slide 33

31 3.-Optimización Composición del Eluyente Optimización en Condiciones Isocráticas Optimización en Condiciones de Gradientes Slide 34

32 Optimización Resolución Cromatográfica ISOCRÁTICO: EFICACIA Tamaño Partícula del Relleno Longitud de la Columna Excesivos Volúmenes Muertos (-) Flujo: N FLOW < 2 µm (STM) 3 µm 5 µm 10 µm Incremento Tiempo Parámetro % Mejora Modificado Resolución Análisis Long. x 2 40% x 2 K : % x 2 K : % x 2 El incrementar la retención por encima de K =5 apenas mejorará la resolución SELECTIVIDAD Fase Estacionaria y Soporte ph Fase Móvil (si ph próximo a pk) Modificador Orgánico y su % Aditivos Fase Móvil Temperatura R s = 2 (T 1 -T 2 ) /( W b1 +W b2 ) N= 5.56 ( T r / w 50% ) 1/2 R s = 0.25 N 1/2 ((α- 1)/ α ) (K'/(K'+1)) α = (T 2 T 0 )/(T 1 T 0 ) K = (T r T 0 ) / T 0 * Para picos de tamaños muy distintos se recomienda R s > 2 R s = f ( K /[K +1] ) k'/k'+1 1,00 0,90 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 0,5 0, OBJETIVO R s > 1.5 (2)* 1 < K'< 10 RETENCIÓN Poder Eluotrópico Eluyente % modificador Orgánico k'/k' K' k' k'/k'+1 T. análisis 0,2 0, x T 0 0,5 0, x T 0 1 0,50 2 x T 0 2 0,67 3 x T 0 3 0,75 4 x T 0 4 0,80 5 x T 0 5 0,83 6 x T ,91 11 x T ,95 21 x T 0 La mejora de Resolución es muy importante al incrementar la retención hasta K = 5 20 Slide 35

33 Optimización Condiciones Isocráticas * Ejemplo optimizacion para Fase Reversa*: R s =0.25 ((α- 1)/ α ) N 1/2 (K'/(K'+1)) OBJETIVO R s > 1.5 (2) 1 < K'< 10 R s =2(T 1 -T 2 )/(W b1 +W b2 ) 1.-DESARROLLO INICIAL: OBJETIVO: LOCALIZAR EL ULTIMO PICO DE LA MUESTRA. Empezar con gradiente 5-100% orgánico en 20 min. Flujo ml/min. O bien con 100% orgánico (si no se dispone de equipo de gradientes). 2.-OPTIMIZACION PODER ELUOTROPICO OBJETIVO: MEJORAR RESOLUCION. Reducir sistemáticamente %orgánico (80,60,50,40%,...), o bien tener en cuenta: DISMINUCION 10% ORGANICO ===> K 2 = (2 ó 3) x K 1 K 1 = (T r -T o )/T o Log K =aprox f lineal (%orgánico) PARA CADA COMPONENTE EXISTE UN UMBRAL DE %ORGÁNICO POR DEBAJO DEL CUAL, ÉSTE QUEDA RETENIDO EN CABEZA DE COLUMNA. ESTE UMBRAL CORRESPONDE APROX. AL 50% DEL QUE PRODUCE K'= OPTIMIZAR "MODIFICADOR ORGANICO" OBJETIVO: MEJORAR SELECTIVIDAD. Emplear tabla de isoeluotropicidades, para cambiar "modificador orgánico" sin cambiar poder eluotrópico 4.- OPTIMIZAR MEZCLA TERNARIA DE "MODIFICADORES ORGANICOS" Con la ayuda de un diagrama ternario optimizar la mezcla de modificadores METANOL / AGUA CLORURO METILENO / HEXANO FASE REVERSA MEZCLA BINARIA MEZCLA TERNARIA FASE NORMAL THF / AGUA ACETONITRILO/AGUA AcOEt/HEXANO THF / HEXANO * Las condiciones descritas hacen referencia a Fase Reversa (con agua y solvente orgánico). Si se trabaja en Fase Normal habrá que sustituir el concepto de solvente orgánico por el de solvente más polar y el de agua por solvente menos polar. Slide 36

34 Composición Fase Móvil "versus" Fuerza Elutrópica 72% Acetonitrilo / Agua 80% Metanol / Agua 53% Tetrahidrofurano / Agua %MeOH %ACN %THF %ACN %MeOH %THF > %THF %MeOH %ACN >100 > >100 >100 Slide 37

35 Ejemplo Optimización Mezcla Ternaria de "Modificadores Orgánicos" METANOL / AGUA 80/20 A METANOL / AGUA 80/20 MEZCLA CH3OH/ACN/H2O 40/35/25 B C THF / AGUA ACETONITRILO/AGUA 70/30 K'= 1 K'= 10 METANOL / ACETONITRILO / AGUA 40/35/25 A C B ACETONITRILO / AGUA 70/30 A C B K'= 1 K'= 10 K'= 5 K'= 1 K'= 10 Slide 38

36 Ejemplo Comparativo de Elución Isocrática versus Gradientes 1 3 METANOL / AGUA 80/20 1 METANOL / AGUA 70/30 GRADIENT ELUTION METANOL / AGUA 90/10 1 GRADIENTE CH3OH/H2O 70/30 A 100/ Si K último pico / K primer pico > 20 mejor utilizar gradientes Slide 39

37 Estrategia Optimización Gradientes de Concentración (Ejemplo en FASE REVERSA) R s =0.25 ((α-1)/ α ) N 1/2 (K'/(K'+1)) OBJETIVO R s > 1.5 (2) 1 < K'< 10 Tiempo equilibrado columna (aprox.)* = 0.15 x T 0 x % * Se podría disminuir equilibrando la columna a un flujo mayor. 1.-DESARROLLO INICIAL: Gradiente 5-100% orgánico en 20 min. * a Flujo ml/min. * a Se recomienda empezar con un 5% de solvente orgánico para evitar el colapso de las fases estacionarios standard. 2.-OPTIMIZACION PENDIENTE GRADIENTE Seleccionar Tg óptimo para gradiente 5-100% * b a) Si Globalmente Falta Resolución Incrementar Tg a 40/60 min % orgánico 100% inicial % orgánico 100% 50% 0% % orgánico 100% K : valor promedio de K durante el gradiente GRADIENT ELUTION min. b) Si Globalmente Sobra Resolución Reducir Tg a 10/15 min. inicial 50% 50% 0% min. Óptimo en el ejemplo propuesto 0% min. * b Si el primer pico aparece muy retenido se puede avanzar empezando con más de un 5% de solvente orgánico. Slide 40

38 GRADIENT ELUTION Optimización Gradientes de Concentración 3.-OPTIMIZAR % ORGANICO INICIAL (X i ) Aumentar % orgánico inicial de 5 a 15,30,40%,... manteniendo constante la pendiente del gradiente para que el primer pico eluya aprox. a 2xT 0 (K =1)*a El correspondiente T g vendrá dado por: T g = (100- X) (T g óptimo )/(100-5) 4.-OPTIMIZAR % ORGANICO FINAL (Y) Reducir % orgánico final a 80,60,40%,... manteniendo constante la pendiente del gradiente El correspondiente T g vendrá dado por: T g = (X i ópt. - Y) (T g óptimo )/(100-X i ópt. ) Conviene minimizar la variación en %orgánico para 0% minimizar el tiempo de equilibrado de la columna 5.-OPTIMIZAR PERFIL MEDIANTE GRADIENTE MULTILINEAL Disminuir la pendiente del gradiente donde falte resolución e incrementarla donde sobre. * b % orgánico 100% 6.-OPTIMIZAR SELECTIVIDAD CAMBIANDO MODIFICADOR ORGANICO Resolver picos aún solapados, mediante un cambio de selectividad al cambiar de "modificador orgánico". OJO CON LOS CAMBIOS DE ORDEN DE ELUCION! % orgánico 100% 50% X 0% % orgánico 100% 50% 0 20 minutos Nuevo Óptimo en el ejemplo propuesto: Óptimo previo en el ejemplo propuesto Óptimo inicial en el ejemplo propuesto minutos SI FALTA RESOLUCION EN LA ZONA FINAL. SI FALTA RESOLUCION EN LA ZONA INICIAL. 0% 18 minutos * a Se deberá aumentar la retención si coeulye con algún otro pico. * b Con gradientes multilineales ir resolviendo los solapamientos en orden creciente de tiempo de retención Y 50% X i 30 0 Nuevo 20Óptimo 40 en el ejemplo propuesto: 18 Slide 41

39 Factor de Capacidad / Retención en Gradientes Flujo (ml/min) Factor de Capacidad ó Retención en Gradientes K = (87 x F x T g ) / ( % x V 0 x S) Tiempo del gradiente (min) Parámetro dependiente de: Analito Modificador Orgánico Volumen muerto de la columna % de incremento de Modificador Orgánico S: definirá la sensibilidad del analito a variaciones en la proporción de modificador orgánico. Valores típicos S: aumentan con el tamaño de la molécula 2-5 moléculas pequeñas / 10 moléculas grandes (péptidos) / 40 moléculas muy grandes (proteínas) Al aumentar el tamaño de la molécula aumenta su sensibilidad a cambios de composición del eluyente. Si K se mantiene constante el poder de separación no variará EJEMPLO 1 - REDUCCIÓN TIEMPO ANÁLISIS: Reducir Tg Aumentando F Al mantener T G x F = constante el perfil de la separación NO varía GRADIENT ELUTION F = 2.0 ml/min T g = 3 min min Columna: ZORBAX Eclipse XDB-C8 4.6x50, 3.5µm Gradiente 45 90% B en 3 y 2 min Fase Móvil: A:25mM Na 2 HPO 4, ph 3 B: Metanol Flujo: 2 y 3 ml/min Temperatura: 35 C Muestra: Fármacos Cardiacos:1. Diltiazam 2. Dipyradamole 3. Nifedipina 4. Lidoflazina 5. Flunarizina F = 3.0 ml/min Tg = 2 min min Time (min) Time (min) Slide 42

40 Factor de Capacidad / Retención en Gradientes: ejemplo Mejora Separación K = (87 x F x T g ) / ( % x V 0 x S) Si K se aumenta el poder de separación mejorará EJEMPLO 2 MEJORA RESOLUCIÓN: Aumentar Tg (el resto de parámetros no se modifican ) GRADIENT ELUTION T g = 10 min 1, , min T g = 60 min min Columna: ZORBAX SB-C8 4.6 x 150 mm, 5 µm Gradiente: 20 60% B en 10 ó 60 min Fase Móvil: A:H 2 O con 0.1%TFA, ph 2 B: Acetonitrilo Flujo: 1.0 ml/min Temperatura: 35 C Muestra Herbicidas: 1. Tebuthiuron 2. Prometon 3. Prometryna 4. Atrazine 5. Bentazon 6. Propazina 7. Propanil 8. Metolaclor Time (min) EJEMPLO 3 - MEJORA RESOLUCIÓN : Reducir V 0 (el resto de parámetros no se modifican ) 1,2 4.6 x 150 mm, 5 µm N = 12,000 (V 0 =1.5ml) Time (min) 15 min Time (min) x 75 mm, 3.5 µm (V 0 =0.75ml) N = 10,000 Columna: ZORBAX SB-C8 8 Gradiente: 20 60% B en 10 min Fase Móvil: A:H 2 O con 0.1%TFA, ph 2 B: Acetonitrilo 2 3 Flujo: 1.0 ml/min Temperatura: 35 C 7 min Muestra Herbicidas: 1. Tebutiuron 2. Prometon 3. Prometryna 4. Atrazine 5. Bentazon 6. Propazina Time (min) 7. Propanil 8. Metolaclor Slide 43

41 Factor de Capacidad / Retención en Gradientes: ejemplo Optimización de Múltiples Parámetros K = (87 x F x T g ) / ( % x V 0 x S) Si K se mantiene constante el poder de separación no variará GRADIENT ELUTION EJEMPLO 4 OPTIMIZACIÓN TIEMPO ANÁLISIS: parámetros no se modifican ( FxT g /V 0 ) ) =Cte. K no varía ) 4.6 x 150 mm, 5µm V 0 = 1.5ml F = 1.0 ml/min T g = 60 min x60/1.5 =40= FxT g /V 0 = 2x15/0.75 = 40 6 Constante K no varía Se mantiene poder de separación 7 40 min x 75 mm, 3.5µm V 0 = 0.75ml F = 2.0 ml/min T g = 15 min Columna: 0 20 Time (min) T g /4 + F x 2 + V 0 /2 (el resto de min 8 ZORBAX SB-C8 Gradiente: 20 60% B en 15 y 60 min Fase Móvil: A:H 2 O con 0.1%TFA, ph 2 B: Acetonitrilo Flujo: 1.0 y 2.0 ml/min Temperatura: 35 C Muestra Herbicidas: 1. Tebutiuron 2. Prometon 3. Prometryna 4. Atrazine 5. Bentazon 6. Propazina 7. Propanil 8. Metolaclor Se reduce Tiempo análisis a 1/6 pero se mantiene la Separación!!! Time (min) Slide 44

42 Algunas Direcciones Web de Utilidad >> Acceso a la página web para búsqueda y visualización de Notas de Aplicación y otras publicaciones de Agilent Technologies: >> Acceso web para inscripción a los Agilent "e-seminars" (gratuita)*, bastará conectarse a la dirección de internet: * En el período Setiembre - Noviembre 2003 se programaran 10 e-seminars en Español sobre HPLC - LC/MS+CE/MS - CE - GC - GC/MS y Validación de Métodos Analíticos >> Acceso web del grupo de análisis químico de Agilent Technologies: >> Acceso web española de Agilent Technologies que permite acceso directo información por técnicas analíticas y productos: HPLC, LC/MS, GC, GC/MS, Electroforesis Capilar, UV/VIS, Columnas y accesorios,... Slide 46

43 Próximos e-seminars en Español - Consideraciones Prácticas en LC/MS y CE/MS (LC/MS CE/MS) - Análisis de Aniones y Cationes por Electroforesis Capilar (CE) - Nuevo Software para Automatizar la Validación de Métodos en Laboratorios Regulados (HPLC GC CE LC/MS CE/MS otros) - Mantenimiento Básico en Cromatografía de Gases (GC) - Operativa y Mantenimiento en GC-MS (GC/MS) - Congelar los tiempos de retención en nuestro GC y GC-MS (GC/MS) - Desorción Térmica- GC/MS: Análisis medioambiental de aire (GC/MS) Está previsto impartirlos en el período Setiembre - Noviembre 2003; si desea más información por favor contacte con: isidre_masana@agilent.com pedro_arranz-zarauz@agilent.com (o telefónicamente: ) Slide 47

44 ANEXOS VARIOS Selección Fases Estacionarias de Exclusión Molecular Base Sílice Fases Poliméricas de Exclusión Molecular Selección Configuración Columna según Aplicación Flujos Elevados para Reducir el Tiempo de Análisis con Columnas de Resolución Rápida Slide 48

45 Selección Fases Estacionarias de Exclusión Molecular: Separación por Tamaño Se deberá escoger un disolvente adecuado para la muestra (GPC: solventes orgánicos / GFC: solventes acuosos /SEC: size exclusion chromatography ) El tamaño de poro de la columna deberá adecuado al rango de tamaño y resolución necesaria de los analitos a separar. Para ampliar rango y resolución se pueden conectar varias columnas en serie (conectarlas en orden ascendente de tamaño de poro las de mayor poro más cerca del detector) Se puede escoger entre columnas Base Sílice o Base Polimérica: GPC+GFC: Solventes Orgánicos y Acuosos BASE SÍLICE (GPC+GFC): ZORBAX PSM ( porous silica microspheres ) (6.2mm x 250mm x 5µm) Fase PSM 60 ó PSM 300 ó PSM 1000 ó PSM 3000 PSM Bimodal Estacionaria PSM 60S PSM 300S PSM 1000S PSM Bimodal S Rango Peso 500 1x x10 1x10 1x10 5x10 Molecular x x x10 6 Las Zorbax PSM pueden utilizarse tanto con solventes orgánicos (GPC) como con soluciones acuosas (GFC). Los tipos S (p.e. PSM 60S - desactivados por silanización) no deben ser usados con soluciones totalmente acuosas. Rango ph 2 7. Alta Resistencia Mecánica GFC: Solventes Acuosos BASE SÍLICE (GFC): ZORBAX GF ( gel filtration ): Especificaciones: ph / hasta 5000psi y < 3ml/min Fase Estacionaria Tamaño Poro y Partícula Rango Peso Molecular ZORBAX GF Å y 4 µm x10 5 ZORBAX GF Å y 6 µm 1x10 4 9x10 5 Separación Anticuerpos Slide 49

46 Fases Poliméricas de Exclusión Molecular: Separación por Tamaño GPC: Solventes Orgánicos BASE POLIMÉRICA (GPC): PLgel (poliestireno-divinilbenceno altamente entrecruzado) (7.5mm x 300mm (5 y 10µm) Tamaño Poro Rango Peso Molecular 50 < < x x x10 5 4x10 4 4x10 6 4x10 5 4x10 7 BASE POLIMÉRICA (GPC): PLgel Mixed-Bed (poliestirenodivinilbenceno altamente entrecruzado) (7.5mm x 300mm (3 a 20µm) Fase Estacionaria Rango Peso Molecular Mixed A x10 7 Mixed B 500 1x Las columnas PLgel y PLgel Mixed Bed son para utilizar con solventes orgánicos GFC: Solventes Acuosos Mixed C 200 3x10 6 BASE POLIMÉRICA (GFC): PLgel aquagel-oh (7.5mm x 300mm (8 µm) 10 6 Mixed D 200 4x10 5 M Mixed E < 3x10 4 PLgel M 10 6 B C D E Curvas Calibración con Poliestireno A V elu PLgel Mixed Bed Tamaño Poro Mixed V elu Rango Peso Molecular 100 3x10 4 1x10 4 2x10 5 5x10 4 1x10 6 2x10 5 1x x Las columnas PL aquagel-oh son adecuadas para solventes acuosos y análisis de polímeros neutros polares Slide 50

47 Selección Configuración Columna según Aplicación Tipo Columna Capilar MicroBore Narrow Bore D.I. (mm) 0.3, Longitud (mm) Tamaño Particula (µm) 3.5, 5 3.5, 5 3.5, 5 Rango Flujos 1 10 µl/min µl/min ml/min Aplicaciones Max sensitibilidad LC/MS Mayor sensitibilidad LC/MS Alta sensitibilidad LC/MS Solvent Saver * , , ml/min Analítica Analítica Semi-preparativa Preparativa , 5 5 5, ml/min 4 10 ml/min ml/min Analítica (Preparat. Analítica.: 1-10mg) Preparativa en pequeña escala mg Preparativa mg * Las columnas de 3mm reducen el consumo de eluyente al 43% del consumido por las de 4.6mm. (las de 2.1mm al 20%). Slide 51

48 Flujos Elevados para Reducir el Tiempo de Análisis con Columnas de Resolución Rápida Presión 90 bar Columna: Zorbax Rapid Resolution StableBond SB-C18, 4.6 x 30 mm, 3.5 µm Sample: 1. Acetaminofenona 2. Cafeína 3. 2-Acetamidofenol 4. Acetanilida 5. Ácido Acetilsalicílico 6. Ácido Salicílico 7. Acetofenetidina 1 2 Rs 2,1 = Rs 7,6 = ml/min 133 bar ml/min N < 2 µm (STM) 3 µm 181 bar 1 Rs 2,1 = Rs 7,6 = segundos!!! 4 ml/min FLOW 5 µm 10 µm Time (min) Las columnas cortas de 3.5µm o STM (sub two micron < 2µm) apenas pierden eficacia a flujos muy elevados Slide 52

49 Columnas de Resolución Rápida para Reducir el Tiempo de Análisis 4.6 x 150 mm, 5 mm x 75 mm, 3.5 mm x 50 mm, 3.5 mm x 30 mm, 3.5 mm x 15 mm, 3.5 mm Time (min) Las columnas cortas con 3.5µm o STM (sub two micron < 2µm) son muy útiles para Análisis muy Rápidos (muy útiles p.e. en desarrollo de métodos) Slide 53

50 Cierre / Conclusiones Finales e-seminar Gracias por asistir a este seminario electrónico organizado por Agilent Technologies. Deseamos les haya resultado útil. Si le interesa, puede descargarse una copia de la presentación de la dirección: Nuestros e-seminars se imparten regularmente. Por favor visite nuestras webs: (versión española) Si tienen dudas adicionales, por favor contacte: Isidro Masana isidre_masana@agilent.com (o telefónicamente: ) Slide 54